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中国科学B辑化学2006,36(5):419~424419SCIENCEINCHINASer.BChemistry痕量纤维蛋白原的银纳米标记免疫共振散射光谱分析*蒋治良**陈媛媛梁爱惠陶慧林唐宁莉钟福新(桂林工学院材料与化学工程系,桂林541004)摘要采用柠檬酸三钠还原法制备了粒径约为8.0nm的银纳米微粒,并用于标记羊抗人纤维蛋白原.在pH5.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中及KCl和聚乙二醇6000(PEG6000)存在下,银标记羊抗人纤维蛋白原与纤维蛋白原发生特异性反应,导致在465nm处的共振散射强度降低.纤维蛋白原浓度在0.067~1.67μg/mL范围内与共振散射强度的降低值呈良好的线性关系,相关系数为0.9974,检出限为0.024μg/mL,用于定量测定人血浆中的纤维蛋白原,结果比较满意.关键词银纳米粒子纤维蛋白原羊抗人纤维蛋白原血清免疫共振散射法收稿日期:2005-09-23;接受日期:2006-08-10*国家自然科学基金(批准号:20365001,20667001)和广西新世纪十百千人才工程计划资助项目**E-mail:zljiang89@126.com人纤维蛋白原(fibriogen,Fg)由肝细胞和巨核细胞合成,是参与凝血过程后期阶段的一个血浆糖蛋白,也是血浆中含量最高的一种凝血蛋白[1].据报道[2],Fg基因缺陷可导致血浆Fg水平的减低或缺失,或引起纤维蛋白原功能异常,临床上以出血症为主.近年来的流行病学研究表明,Fg与心血管疾病、血栓病、糖尿病及恶性肿瘤等密切相关,高水平的Fg是冠心病的危险因素之一,它的检测已作为诊断消耗性凝血病的重要指标[3~5].目前Fg测定方法主要有免疫学方法[6,7]、功能测定法[3,8~12]和物理化学法三类.其中血凝、免疫比浊、酶联免疫吸附、放射免疫、火箭电泳、单向免疫扩散等免疫学方法的选择性好,灵敏度较高,最低检测限达到0.15mg/L,且简便快速,在诊断某些Fg异常相关性疾病时发挥了较大的作用.功能测定法包括重量测定法[8]、分光光度法[9,10]、动态Fg测定法[3]和vonClauss法[11],这类方法的灵敏度较低.物理化学测定法可分为盐析法、热沉淀法和电泳法等.盐析法常以双缩脲试剂显色,在10g/L以内线性良好,最低检测限为0.5mg/L.这类方法快速简便,但是特异性不强,影响因素较多.此外,还有PT演算法,其线性范围为0.490~2.45g/L[13].该法经济、简单、快速[14],在Fg含量正常时,该法与Clauss法有很好的相关性,但当Fg减低时,结果偏高[15].银胶在免疫金银法中常用作染色剂,以提高免疫金反应的灵敏度[16].利用银胶的增强作用测定蛋白质也有见报道[17,18],但用银标记探针测定蛋白质420中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry含量的报道较少.共振散射光谱分析具有快速、简便、灵敏等特点.已用于核酸[19]、液相纳米微粒研究,及核酸[20,21]、糖类[22]、蛋白质[23~25]等的分析,但进一步提高选择性是其重要研究方向之一.近来,我们将螯合物微粒反应、催化反应等与共振散射光谱分析结合,在提高其选择性方面获得较好的结果[26,27],但将特异性的免疫反应与共振散射技术结合鲜见报道.本文发现,在PEG和KCl存在下,银标记羊抗人Fg与Fg的特异性免疫反应导致体系共振散射猝灭,据此建立了一个定量分析人血浆中Fg的新方法.该法简便、快速、灵敏且选择性好.1实验1.1主要仪器及试剂RF-540型荧光分光光度计(日本岛津);纳米粒度与Zeta电位分析仪(NaNo-ZS90,英国Malvern公司);79-1磁力加热搅拌器(江苏中大仪器厂);SK8200LH超声波反应器(上海科导超声仪器有限公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析).羊抗人纤维蛋白原血清(简称为抗Fg,上海申峰生物试剂有限公司),1.0mg/mL纤维蛋白原(Fg),2.0×10−3mol/LAgNO3,磷酸盐缓冲溶液(PBS),1.0%柠檬酸三钠,15.0%聚乙二醇(PEG)4000,15.0%PEG6000,3.0%PEG10000,3.0%PEG20000,100mg/mLKCl.所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.1.2银胶体的制备参考文献[28],取10.0mL2.0×10−3mol/LAgNO3于250mL锥形瓶中,加入185mL蒸馏水,加热至沸;在磁力加热搅拌作用下,缓慢加入5.0mL1.0%柠檬酸三纳,保持沸腾30min后流水冷却,转移至200mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,得到浅黄色银胶体.对上法制备的银胶体进行了激光散射表征,结果如图1(a)所示,平均粒径为8.0nm.1.3免疫银探针的制备1.3.1待标抗Fg血清的处理由于实验购置的抗Fg中含有一定量的电解质,影响银胶体的标记,且极易使银胶体发生团聚,所以标记前应将抗Fg放入透析袋,在含0.005%NaCl的溶液中,于4℃下透析48h以上,备用.1.3.2银胶体标记pH值的选择取不同pH值的银胶体1.0mL(5.67μg/mLAg),分别加入20μL抗Fg,5min后加入0.50mL的100mg/mLKCl溶液,放置2h,稀释至3.0mL,测定其465nm处的共振散射光强度I465.结果表明,当pH值小于6.0,抗Fg本身会发生聚集沉淀和吸附,因而不能起到稳定银胶体的作用,当加入KCl以后,银溶胶发生聚沉;随着pH值(4.5~6.0)增大,I465增大.当pH值大于6.0,抗Fg将银胶体包裹,KCl不能使银胶体发生聚集,因而I465较大且趋于稳定.据报道[29,30],Fg等电点为5.5,当银胶体的pH值达到等电点或偏碱的条件下,银胶体与抗Fg才能结合牢固.由实验结果可知,本法标记的pH值与报道一致,故选择银胶体标记抗Fg的pH值为6.5.标记前,用0.20mol/LK2CO3和0.1mol/LHCl调节银胶体的pH值.1.3.3抗Fg用量的确定在注入1.0mL银胶体(pH=6.5)的一组比色管中,分别加入一定量的抗Fg(0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50μg),放置5min后加入0.50mL的100mg/mLKCl溶液,混匀,2h后稀释至3.0mL,测定其I465.结果表明,当抗Fg的量小于等于25μg时,I465随抗Fg加入量的增加而增大;当血清量等于且大于30μg(30~50μg)时,I465较大且基本保持不变.所以30μg为标记1mL(5.67μg/mL,以Ag计)银胶体的最低量,即标记100mL银胶体所需抗Fg为3.0mL.1.3.4银标记抗Fg的制备用0.20mol/LK2CO3和0.10mol/LHCl将100.0mL银胶体及3.0mL抗Fg均调节pH值至6.5,因蛋白质会损坏酸度计探头,所以用精密试纸调节pH值.在磁力搅拌作用下,将3.0mL抗Fg缓慢滴加到100.0mL银胶体中(滴加时间控制在5min内),然后再加入1.75mL3%PEG20000作为稳定剂(使其终浓度为0.2%),搅拌15min后,于4℃保存备用.第5期蒋治良等:痕量纤维蛋白原的银纳米标记免疫共振散射光谱分析421μg/mL银标记抗Fg溶液(以Ag计),一定量Fg溶液,0.50mLKCl溶液,0.30mLPEG6000溶液于10mL比色管中,定容至3.0mL后混匀,置于超声波反应器(工作频率为59kHz)中温育30min.移入石英池中,在荧光分光光度计上,用低灵敏档,纵坐标为4,同步扫描激发波长λex和发射波长λem(λex=λem),得到体系的共振散射光谱.测定465nm波长处的共振散射光强度I465;不加Fg作空白,测其共振散射光强度I0465.计算ΔI465=I0465−I465.2结果与讨论Fg与抗Fg生成的免疫复合物微粒存在着较弱的散射,直接用于测定灵敏度不高.银胶体的共振效应与其粒径有关.在银胶体中加入一定量的电解质可使小粒径的银纳米微粒向大粒径转变[31],乃至出现沉淀及吸附在管壁,导致共振散射强度大大降低,即共振散射猝灭.在银标记抗Fg血清中,银纳米粒子被标记在抗Fg上,即使在含KCl及PEG6000的溶液中也能够稳定存在.当抗Fg与Fg发生特异性反应后,生成的免疫复合物沉淀了下来,裸露的银纳米颗粒在KCl及PEG6000的作用下发生聚集沉淀及吸附于试管壁,共振散射强度降低.在一定条件下,随着Fg原浓度的增加,参加反应的抗Fg越多,释放的银纳米颗粒也就越多,聚集沉淀程度不断增强,共振散射猝灭程度相应增强,并与Fg的浓度呈良好的线性关系,据此可建立Fg的共振散射测定新方法.2.1激光散射粒径分布通过激光散射粒径分布可以看出,柠檬酸三钠制备的银纳米粒子粒径较小(图1(a)),大约在8.0nm左右,且分布较均匀.当银纳米粒子标记于抗Fg后,其粒径有所增大(图1(b)),平均粒径约在12.0nm左右,故标记后体系的共振散射会有所增强,但幅度不大.在银标抗Fg血清中加入Fg,KCl及PEG6000后,由于银标抗Fg与Fg发生特异性反应,使裸露的银纳米颗粒发生聚集乃至沉淀,粒径迅速增大(图1(c)),平均粒径约为1.08×103nm.2.2共振散射光谱Fg及抗Fg的共振散射均弱.Fg在340,400,420,520nm均有共振散射峰出现,在470nm处有一个同图1激光散射粒径分布(a)17μg/mL银胶体;(b)5.67μg/mL银标抗Fg血清;(c)pH5.8,PBS-5.67μg/mL银标抗Fg-0.53μg/mLFg-16.7mg/mLKCl-30mg/mLPEG6000422中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry步散射峰,其中340nm处的共振散射峰最强.抗Fg在340,400,420,520nm也有4个共振散射峰,340nm处峰最强.Fg与抗Fg发生特异性反应后,谱图与Fg及抗Fg相似,在340,400,420,520nm均有共振散射峰,但由于生成了免疫复合物,所以共振散射强度明显增大.银胶体本身的共振散射峰与仪器的同步散射峰重叠,均在465nm附近.此外,在440nm处还有一共振散射峰(图2(a)),但银纳米粒子标记于抗Fg后,440nm处的峰消失,仅在465nm处有一共振散射峰(图2(b)).当Fg与抗Fg发生特异性反应后,并没有明显的特征峰出现(图2(c)),只是465nm处的特征峰位明显降低,这是因为释放出的银纳米颗粒发生聚集沉淀和吸附,导致共振散射强度发生猝灭.随着Fg浓度的增加,共振散射强度降低渐成线性.本实验选取465nm.2.3pH值及缓冲溶液用量的选择考察了不同pH值对ΔI465的影响.结果表明,当pH值为5.8时,ΔI465最大,所以实验选择pH值5.8.同时还对比了Tris-HCl缓冲溶液对本体系的作用,结果发现,PBS灵敏度较高.当PBS(0.053mol·L−1PO43−)的用量为0.80mL时,ΔI465最大.2.4PEG及其浓度的选择一定量的聚乙二醇或KCl都会使银胶体发生聚集沉淀,导致共振散射强度降低,但降低的程度很不明显.但同时加入聚乙二醇和KCl,共振散射强度显著降低,大大提高了其灵敏度.对银标记抗Fg进行了实验,由于蛋白质的作用,银胶体可以稳定存在于PEG及KCl溶液中,并未发生聚集.分别试验了PEG4000,PEG6000,PEG10000和PEG20000浓度对ΔI465的影响.结果表明,不同分子量的PEG对ΔI465都有一定的增强作用,其中PEG6000尤其显著.当PEG6000浓度为30.0mg/mL时,ΔI465有最大值.2.5银标记羊抗人纤维蛋白原浓度的影响随着银标记抗Fg浓度的增加,ΔI465增加;当浓度为5.67μg/mL银标记抗Fg的用量为1.0mL时,ΔI465达到最大值.2.6KC