谷氨酸对大鼠纹状体神经元活动的影响-ahref=htt

中华硕博网研究生论文谷氨酸对大鼠纹状体神经元活动的影响庄晓燕高素华张红焦金菊志杰摘要目的：研究谷氨酸及受体阻断剂MK-801对雄性大鼠纹状体神经元自发放电活动的影响。方法：应用微电泳方法记录纹状体神经元自发放电活动。结果：微电泳GLU使84.13%STR神经元自发放电频率加快。在43个STR神经元中直接微电泳MK-801可使62.79%STR神经元自发放电频率降低。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU期间给予MK-801拮抗GLU的兴奋效应，可使90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢。结论：GLU对STR神经元起兴奋作用，但其兴奋作用可被MK-801所拮抗，当直接微电泳MK-801时，可使STR神经元产生抑制效应。研究提示抗谷氨酸作用的药物有抗帕金森病的作用。关键词微电泳;纹状体;谷氨酸;MK-80纹状体是基底神经节中的一个重要核团，由尾核、壳核和苍白球组成。尾核和壳核称为新纹状体;苍白球称为旧纹状体。本研究指的是新纹状体。它主要接受大脑皮层和皮层下的传入纤维，再发出轴突投射到苍白球和黑质［1］。这些核团间存在着复杂的纤维联系，共同参与躯体运动的调节。因此本实验采用微电泳及细胞外记录方法观察GLU和阻断剂MK-801对STR神经元自发放电活动的影响，以探讨GLU在躯体运动中的调节作用。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物采用Sprague-Dawley雄性大鼠40只，体重250g±30g，由辽宁医学院实验动物中心提供。1.1.2实验试剂GLU、MK-801、焦油紫均由美国Sigma公司提供，乌拉坦、多聚甲醛由沈阳化工试剂厂提供。其它均为国产分析纯试剂。1.1.3实验仪器脑立体定位仪;51217型微管拉制仪;微电泳仪;SMUP生物信号处理系统;CM800冰冻切片机;OLYMPUS光学显微镜。1.2实验方法1.2.1手术以20%乌拉坦腹腔麻醉后，将大鼠置于脑立体定位仪上行常规开颅术。1.2.2微电泳及细胞外记录根据PaxionsWatson的大鼠脑图谱［2］，对纹状体定位。坐标为前囟后-0.8～1.2mm，中线旁开2.5～3.5mm，脑表下5.0～6.0mm。采用51217型微管拉制仪所拉制的3管玻璃微电极，尖端直径4～8μm，中心管管内灌注含1%滂胺天蓝的3.0MNaCl溶液作为神经元放电活动的引导电极，外周管电阻为20～100MΩ，按需要分别灌注以下药物：GLU、MK-801、NaCl。借助微电极推进器将微电极缓慢插入纹状体，记录STR神经元自发放电情况。使用微电泳仪进行微电泳，电泳电流为10～150nA，电泳时间为20s，滞流电流为5～10nA，可根据实验需要及神经元情况进行适当调节。除GLU外，其余皆用正电流泳入。分别观察GLU及MK-801对STR神经元放电活动的影响。再在微电泳GLU期间，给予MK-801，观察对STR神经元放电的影响。为了排除可能发生的电流作用，只要注入NaCl引起任何放电变化，该资料则不列入统计。神经元放电活动由微电极引导信号，经放大器放大、滤波、显示于示波器上，并输入SMUP生物信号处理系统，计数神经元放电情况，结果自动制成序列密度直方图。1.2.3组织学定位实验结束后，经中心管给予20μA阴极直流电，经微电极电泳滂胺天蓝到记录部位，通电10～15min。对麻醉后实验动物开胸，经升主动脉首先用100ml生理盐水快速冲洗血管后，继而用含4%多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液500ml灌流固定。开颅取出完整脑组织，做成长度为1.5cm的组织块，放入含4%多聚甲醛的磷酸固定液中固定;再将组织块移入含20%～30%蔗糖磷酸缓冲液中，浸至其沉底。24h后，置于0.1M磷酸缓冲液中脱糖，后置于连续冰冻切片机内，-20°C，做连续冠状切片，切片厚30μm。焦油紫染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下进行组织学鉴定并拍照。1.2.4数据处理分别记录微电泳前后神经元放电频率，同时还记录微电泳后神经元兴奋或抑制的持续时间。微电泳药物后放电频率变化=/电泳前20s放电频率×100%。微电泳药物后放电变化超过±30%为有效临界值，进行统计分析。统计资料以均数±标准差表示，进行t检验，比较显著性差异。以P0.05为差异显著性指标，P0.01为差异极显著性指标。2实验结果共观察了63个STR神经元。其中84.13%STR神经元在微电泳GLU之后自发放电频率加快，平均放电频率由微电泳前的1.74±0.94Hz增加到3.31±1.63Hz，给药前后放电频率差异显著。GLU对STR神经元放电影响特点是作用明显、迅速，无潜伏期，无明显后作用，停止微电泳GLU后，放电迅速恢复到基础水平。另有11.11%STR神经元对GLU无反应，4.76%STR神经元微电泳GLU后表现为抑制作用。在43个STR神经元中直接微电泳受体阻断剂MK-801，可使62.79%STR神经元自发放电频率降低，平均放电频率由微电泳前的2.18±1.18Hz降低到1.53±1.20Hz，给药前后差异极显著。MK-801作用特点是作用缓慢而持久，有潜伏期，且有明显的后作用，平均后作用时间为37.76±9.01s，电泳MK-801停止后需较长时间的后抑制，放电才逐渐恢复至基础水平。另使4.65%STR神经元放电频率加快，32.56%无明显变化。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU期间给予MK-801拮抗GLU的兴奋效应，可使90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢，平均放电频率由微电泳MK-801前的3.22±1.41Hz减少到1.49±0.83Hz，给药前后具有极显著性差异。另有9.09%已产生兴奋效应的STR神经元对MK-801无反应。见表1，图1。图1GLU及MK-801对STR神经元放电的影响表1GLU及MK-801对STR神经元放电的影响3讨论目前研究结果表明，基底神经节与大脑皮层之间的回路主要有两条［3］：一为直接通路，二为间接通路。直接通路是从皮层广泛区域→新纹状体→苍白球内侧部→丘脑前腹核和外侧腹核→皮层运动前区的神经通路;间接通路是指皮层广泛区域→新纹状体→苍白球外侧部→丘脑底核→苍白球内侧部→丘脑前腹核和外侧腹核→皮层运动前区的神经通路。纹状体主要接受来自大脑皮层的GLU能纤维、苍白球外侧部的γ-氨基丁酸能纤维及黑质的多巴胺能纤维。在随意运动的控制中，两条通路的平衡非常重要。本实验观察到微电泳GLU使84.13%STR神经元放电频率加快，平均放电频率由微电泳前的1.74±0.94Hz增加到3.31±1.63Hz，给药前后放电频率差异显著。从图1可见GLU对STR神经元放电影响特点是作用明显、迅速，无潜伏期，无明显后作用，停止微电泳GLU后，放电迅速恢复到基础水平。此结果表明GLU对STR神经元起兴奋作用。GLU受体有两类：一类为离子型GLU受体，GLU是通过激活了配体门控阴离子通道而发挥作用;另一类为代谢型GLU受体，是通过与G蛋白耦联来调节兴奋型突触的活动和神经元的兴奋性［4］。在43个STR神经元中直接微电泳MK-801，可使62.79%STR神经元自发放电频率降低，平均放电频率由微电泳前的2.18±1.18Hz降低到1.53±1.20Hz，给药前后差异极显著。MK-801作用特点是作用缓慢而持久，有潜伏期，且有明显的后作用，平均后作用时间为37.76±9.01s，电泳MK-801停止后需较长时间的后抑制，放电才逐渐恢复至基础水平。此结果表明直接微电泳MK-801时，可使STR神经元产生抑制效应。在微电泳GLU产生兴奋效应的33个STR神经元中，微电泳GLU期间给予MK-801拮抗GLU的兴奋效应，可使90.91%已对GLU产生兴奋效应的STR神经元放电频率减慢，平均放电频率由微电泳MK-801前的3.22±1.41Hz减少到1.49±0.83Hz，给药前后具有显著性差异。此结果表明在基底神经节环路中，主要来自大脑皮层的GLU能对STR神经元施加兴奋作用，但其兴奋作用可被非选择性NMDA受体阻断剂MK-801所拮抗，进一步表明调节该兴奋作用的受体至少有NMDA受体的参与，提示STR神经元存在NMDA受体［5］。MK-801属于开放通道阻滞剂，作用于对膜电场敏感的NMDA受体-通道内部。由于纹状体是引起帕金森病的主要核团，而GLU对PD的产生起重要的介导作用。新近研究表明L-GLU与PD发病有关，提示抗谷氨酸作用的药物有抗PD作用。