搜索
340中国科学C辑生命科学2006,36(4):340~345SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式*侯健刘蕾雷霆华崔秀宏安晓荣**陈永福(中国农业大学生物学院和农业生物技术国家重点实验室,北京100094)摘要利用抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)抗体免疫荧光法检测了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)的牛合子及早期胚胎的基因组甲基化模式.实验结果表明:有61.5%的合子发生了雄原核去甲基化,而34.6%的合子没有发生去甲基化;当胚胎发育到8-细胞时,甲基化水平明显下降,且一直到桑椹胚期仍维持低甲基化状态,但同一枚胚胎的不同卵裂球之间甲基化水平不同;在囊胚期,内细胞团细胞的甲基化水平很低,而滋养层细胞的甲基化水平却很高.本研究结果至少部分地提示,IVM/IVF/IVC可能对牛合子及早期胚胎的甲基化模式有一定影响.关键词甲基化胚胎抗5-甲基胞嘧啶抗体体外受精牛收稿日期:2005-07-24;接受日期:2006-03-08*国家自然科学基金(批准号:30270956)和国家“863”计划(批准号:2002AA206311)资助项目**联系人,E-mail:xra@cau.edu.cnDNA甲基化是哺乳动物最主要的表观遗传修饰,主要发生在基因组的CG二核苷酸的胞嘧啶上.DNA甲基化与转录抑制有关,参与调节基因的组织特异性表达、X染色体失活、基因印记和染色质结构等生物功能[1~3].在分化组织的细胞中,基因组甲基化模式相对稳定,并随细胞分裂而传递.但在哺乳动物发育过程中要经历两次广泛的基因组甲基化模式重编:一次在生殖细胞形成过程中;一次在早期胚胎的着床前发育过程中[2].在小鼠合子,父本基因组在受精后不久即发生快速的主动去甲基化过程[4,5],而母本基因组则在随后的卵裂过程中经历逐渐的、依赖于DNA复制的被动去甲基化[6].小鼠早期胚胎主动和被动的去甲基化过程已在大鼠、猪、牛和人等其他物种上得到证实[7~10],但在绵羊和兔的受精卵中没有观察到这一现象[9,11],暗示早期胚胎的甲基化模式可能存在物种差异.虽然牛早期胚胎的基因组甲基化模式已有报道,但在不同的研究报道中,关于精子基因组主动去甲基化的程度以及重新发生甲基化的时期等方面的研究结果有所不同[7~9].这可能与不同作者所使用的检测方法和实验体系的差异有关.基因组甲基化模式的重编可能与基因印记模式的重建和发育全能性的恢复有关.已有的研究显示,异常的甲基化模式可能是导致胚胎发育失败的原因之一.比如,通过核移植技术生产的克隆胚胎存在明显异常的甲基化模式[7,8,12~15].因此,了解早期胚胎的基因组甲基化模式对研究胚胎发育机制、解析胚胎发育失败的原因具有重要意义.抗5-甲基胞嘧啶第4期侯健等:牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式341(5MeC)抗体免疫荧光染色法是最近发展起来的研究早期胚胎基因组甲基化模式的新方法,本研究采用这一方法对体外受精牛胚胎的基因组甲基化模式进行了检测,并得到了一些新发现.1材料与方法1.1试剂及培养用品培养基TCM199购自Gibco公司.培养皿购自Corning/Coster公司.其他试剂如无特殊说明均为Sigma公司产品.1.2牛卵母细胞的体外成熟、体外受精以及胚胎体外培养(1)卵母细胞体外成熟(IVM):牛卵巢采自内蒙古呼和浩特市当地屠宰场.采集到的卵巢放在30℃生理盐水中,短时间内带回实验室.用带有18号注射针头的一次性注射器从卵巢表面2~5mm卵泡中吸取卵母细胞.挑选带有3层以上卵丘细胞且胞质均匀的卵母细胞用于体外成熟.成熟培养液为添加10%胎牛血清(FCS)、10μg/mL促卵泡激素(FSH,Vetre-pharm,Canada)、10μg/mL促黄体素(LH,Bioniche,Canada)和1μg/mL17β-雌二醇的TCM199.培养条件为38.5℃,5%CO2,95%空气,饱和湿度.卵母细胞在体外成熟22~24h后用0.2%(体积比)透明质酸酶溶液处理除去大部分卵丘细胞(保留1~3层),然后用于体外受精.(2)卵母细胞体外受精(IVF):在37℃水浴中快速解冻冷冻精子,然后加入到5mL预热的受精液(BO+0.3%牛血清白蛋白BSA＋30μg/mL肝素)中,以1000r/min离心洗涤1次.离心后去上清,将精子沉淀加入到1mL受精液中,上游孵育30min.取上游的精子直接制成50μL受精液滴,以矿物油覆盖.然后将成熟好的卵子加入受精液滴中.在精卵孵育5~6h后将卵子移出受精液滴,转入胚胎培养微滴中培养.(3)受精卵体外培养(IVC):胚胎前期培养液为合成的输卵管液SOF+2%非必需氨基酸(Gibco)＋1%必需氨基酸(Gibco)+4mg/mLBSA.培养48h后转入与单层卵丘细胞共培养,并在培养液中补充10%FCS.胚胎培养条件为38.5℃,5%CO2,95%空气,饱和湿度.在受精后48h统计卵裂率,第9天统计囊胚发育率.1.3胚胎固定及免疫组织化学染色在受精后20h收集1-细胞胚胎,在随后适当时期收集各发育阶段胚胎.参照文献[9,14]对胚胎进行固定和免疫荧光染色.胚胎用0.5%链霉蛋白酶溶液除去透明带,放入4%多聚甲醛中于4℃固定1~7天.固定好的胚胎用含有0.3%BSA的PBS多次洗涤,在室温下用0.5%TritonX-100中透化45min.再用4mol/LHCl在37℃下处理1h,然后在2%BSA的PBS中封闭过夜.为检测DNA甲基化,胚胎与抗5MeC单克隆抗体(Eurogentec,Belgium,1:300dilution)孵育1h,充分洗涤后,再与FITC偶联的抗小鼠二抗(1:150)孵育1h.观察前,再用20μg/mL碘化丙锭(propidiumiodide,PI)染色20min,然后将胚胎固定在载玻片进行观察.1.4免疫荧光观察在激光共聚焦显微镜(Confocol,Bio-RadMRC1024ES)下观察染色的胚胎,激发波长为488(FITC)和568nm(PI).为了严格比较不同发育阶段胚胎的甲基化水平,使用相同的Confocol参数观察每一个胚胎.捕获的图像利用ConfocalAssistantsoftware保存为TIFF文件格式.随后的图像处理使用Photoshop7.0软件.2结果2.1抗体的特异性本研究首先对抗5MeC抗体的特异性和免疫荧光染色方法的有效性进行了检验.在预实验中分析了小鼠各发育阶段的胚胎.1-细胞胚胎的染色结果显示,雄原核的抗体染色非常浅,而雌原核的染色很重(图片略),这与文献报道的雄原核特异性的主动去甲基化过程一致[4,16].单独使用一抗或二抗染色的各阶段胚胎均没有任何着色.这些结果表明,本研究所用的抗体和染色方法是有效的.342中国科学C辑生命科学第36卷SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences2.2牛合子的基因组甲基化模式共进行了5次牛体外受精实验.受精后20h取部分假想的1-细胞胚胎用于免疫荧光检测,只有PI染色鉴定的带有明显双原核的合子作为真正的受精卵(表1).抗5MeC抗体免疫荧光染色的结果显示,在检测的26个双原核合子中,有16个合子(61.5%)的雌雄原核呈现不均一的染色强度,即1个原核染色重,另1个原核染色较轻(图1(a)).其余10个合子中,有9个合子的(34.6%)的两个原核显示出相近的染色强度(图1(b)),另外1个合子的两个原核都呈染色阴性.表1牛合子的免疫荧光染色结果5MeC抗体染色结果/%用于检测的假想合子数双原核合子雌/雄原核染色不同雌/雄原核染色相同632616(61.5)9(34.6)图1牛合子的基因组甲基化模式(a)两个原核的抗5MeC免疫荧光染色强度不同,一个原核的染色较轻(箭头所示),另一个染色较重;(b)两个原核的抗5MeC免疫荧光染色强度相同.右上角方框中为PI染色示核.标尺比例10μm2.3牛分裂期胚胎的甲基化模式取部分卵裂胚胎继续培养,各阶段的发育比例见表2.在培养不同时期,取发育不同阶段的胚胎进行抗5MeC抗体免疫荧光染色(共28枚).结果显示,从8-细胞期开始,可以观察到免疫荧光的染色强度明显降低(图2).但我们发现,即使在同一枚胚胎中,不同卵裂球的染色强度不同,相比之下有些细胞的染色非常浅(图2(b),箭头所示),而且这种卵裂球间不均一的染色甚至一直持续到晚期桑椹胚.在随后的发育阶段(8-细胞到桑椹胚),我们没有观察到细胞的甲基化水平有明显升高,而是多数细胞一直保持较浅的染色,只有少数细胞变得染色加重(图2(c)和(d),箭头所示).2.4囊胚的甲基化模式共对12枚形态良好的牛囊胚进行了抗5MeC抗体免疫荧光染色.我们观察到所有囊胚的滋养层细胞染色很重,而内细胞团细胞却染色非常浅(图3).这一结果出乎作者的预料,也和其他学者先前报道的结果不同[7].3讨论利用免疫荧光染色的方法不但可以分析单个胚胎的全基因组甲基化模式,同时也可以了解同一枚胚胎不同细胞核的甲基化水平.本研究利用这一方法对牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式进行了研究,重点在于检测不同胚胎及不同细胞核之间的甲基化差异.作为对照,我们在90%以上的小鼠合子中观察到典型的去甲基化过程,即:雄原核染色很淡或没有着色,而雌原核染色很重(图片略).但对牛合子的染色结果与小鼠有所不同.虽然我们在大多数(61.5%)牛合子中也看到一个重染的原核(推测为雌原核)和一个淡染的原核(推测为雄原核),但牛雄原核的免疫荧光染色强度仍高于小鼠的雄原核[17].这一观察结果支持Beaujean等人[9]的观点,即:牛雄原核的去甲基化只是部分的,而不是完全的.牛合子中期染色体标本的分析结果也显示,雄原核基因组的去甲基化只发生在常染色质区,而着丝点附近的异染色质仍保持高水平的甲基化[8].这些结果都与Dean等人[7]报道的牛雄原核完全去甲基化的结果不同.但需要指出的是,在我们及他人的研究中,所检测的牛合子均来自表2牛体外受精胚胎的体外发育率发育率/%受精卵母细胞数卵裂数培养胚胎数4~8细胞8~16细胞桑椹胚囊胚403206(51.1%)12195.4(115/121)83.8(88/105)49.4(42/85)37.5(21/56)第4期侯健等:牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式343卵裂期牛胚胎的甲基化模式(a)4-细胞胚胎;(b)8-细胞胚胎,可见部分卵裂球染色很轻(箭头所示);(c)10~16-细胞期胚胎;(d)桑椹胚.从8-细胞以后,可见部分卵裂球的抗5MeC免疫荧光染色强度增加((c)和(d)中箭头所示),但桑椹胚的大多数细胞仍染色较轻.右上角方框为PI染色示核.标尺比例10μm体外成熟和体外受精,而作为对照的小鼠合子则全部来自体内受精卵.因此,关于体外成熟和体外受精体系是否影响牛雄原核的去甲基化程度并造成不同研究者之间实验结果的差异,值得考虑.我们发现,在38.5%的牛合子中,两个原核呈现相近的染色强度,表明在这些合子的雄原核并没有发生去甲基化.这在先前其他学者的研究中并未报道[7,9].我们推测这些没有发生去甲基化的合子可能是由于卵母细胞的不完全成熟造成的.这种推测受到最近发表的一项研究的支持.这项研究表明,来源于体外成熟卵母细胞的猪受精卵,只有40%发生了雄原核的去甲基化,远远低于那些来源于体内卵母细胞的受精卵[18].虽然牛卵母细胞的培养体系远比猪的成熟,但其质量仍低于体内来源的卵母细胞[19].所以,卵子胞质的不完全成熟可能导致部分合子不能发生主动去甲基化.然而,关于哺乳动物受精卵主动去甲基化的机制目前仍不清楚.最近的资料表明,除卵母细胞外,精子自身的成分也对去甲基化过程344中国科学C辑生命科学第36卷SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences图3牛囊胚的基因组甲基化模式(a)抗5MeC免疫荧光染色结果,可见内细胞团细胞的染色强度明显低于滋养层细胞;(b)PI染色示内细胞团和滋养层.标