法尔目前任职于美国麻省理工学院

法尔目前任职于美国麻省理工学院，梅洛目前在美国哈佛大学工作。他们将分享1000万瑞典克朗（约合140万美元）的奖金。2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了“RNA（核糖核酸）干扰”机制。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。梅洛(CraigMello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。法尔(AndrewFire)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。RNA干扰RNAinterference，RNAi南通大学生命科学学院谭湘陵一、RNA干扰的发现94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression)一、RNA干扰的发现1995年，康乃尔大学的SuGuo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。论文：GuoS,KemphuesKJ,ParL.Cell,1995,81:611-620.一、RNA干扰的发现1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干扰。论文：FireA,XuS,MontgomeryME,etal.Nature.1998,391:806-811.(A)Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.一、RNA干扰的发现在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。2000年提出RNAi作用机制模型。论文：HannondSMetal.Nature,2000,404(6775):293-296ZamorePD.Cell,2000,101(1):25-332001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，2001，411（6836）：494－498RNAi技术被《Science》评为2001年度的十大科技进展之一。二、RNA干扰的机制dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链Dicer：属于RNaseⅢ家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，依赖RNA的RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递预备知识：基因沉默二、RNA干扰的机制转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致；PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。基因沉默目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA,抑制相应基因的表达。均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：二、RNA干扰的机制第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的两条单链末端为5’-磷酸和3’-羟基，且3’端均有2-3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。二、RNA干扰的机制第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。RNAi的放大效应机制二、RNA干扰的机制siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（randomdegradativePCR）。GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；②RNAi具有很高的特异性；③只有dsRNA才能诱导产生RNAi；④只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；⑤注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解；⑥RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；二、RNA干扰的机制RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：二、RNA干扰的机制⑦RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。⑧dsRNA不得短于21个碱基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；⑨RNAi作用迅速，mRNA快速降解；⑩RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：三、RNA干扰的应用1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。三、RNA干扰的应用2.病毒性疾病的治疗研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。艾滋病三、RNA干扰的应用2.病毒性疾病的治疗Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已转染含1.3XwtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X-siRNA或core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。HBV三、RNA干扰的应用2.病毒性疾病的治疗Randall等证明了针对HCVRNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍；将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。HCV三、RNA干扰的应用2.病毒性疾病的治疗RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫