基因工程菌自诱导IL-7 蛋白表达的研究

方亮，蔡倩影，王航，孟春*福州大学生物科学与工程学院，福州（350002）E-mail：[e-mail]摘要：本工作采用乳糖自诱导的诱导培养替代传统异丙基硫代乳糖苷（IPTG）的诱导，研究乳糖自诱导培养菌种的生长和蛋白的诱导表达规律；对乳糖浓度、接种量和溶解氧浓度对乳糖自诱导培养的影响亦进行了研究。实验结果表明，利用乳糖自诱导，在不添加抗生素的条件下，可以达到与IPTG类似的诱导效果，菌体浓度可达到IPTG的诱导水平的171%。关键词：生物工程；IL-7；乳糖自诱导；大肠杆菌中图分类号：Q8191.引言IPTG是常见的大肠杆菌基因工程菌的诱导剂，但由于其昂贵的价格和潜在的毒性，使其应用于大规模培养生产重组蛋白时有一定的局限性[1]。乳糖是一种二糖,安全且价格低廉，使其有可能成为替代IPTG的诱导剂。乳糖本身可作为碳源,它通过乳糖透过酶和β-半乳糖苷酶[2，3]的作用转化为异乳糖,异乳糖作为诱导剂启动PET载体中的T7启动子，从而开始目的蛋白质基因的转录。与IPTG相比,利用乳糖作为诱导剂其诱导过程更为复杂，目前仅有少量的利用乳糖作为诱导剂诱导重组产物表达的研究报道,且研究时主要是将乳糖作为诱导剂添加来使用，然而在高密度培养中直接应用乳糖作为底物进行生长和诱导产物表达（又称自诱导）的研究则少见报道。本工作以乳糖直接作为碳源又作为诱导剂，来研究重组基因工程菌表达白细胞介素-7（IL-7），在此基础上进行培养条件的优化。2.材料与方法2.1菌株和培养基E．coliBL21(ED3)含pET-27b（+）(Novagen)/IL-7重组质粒，由本实验构建。种子培养基选用LB培养基(g/L)：tryptone10,yeastextract5,NaCl10；自诱导培养培养基(g/L)：tryptone10,yeastextract5，NaCl10，Lactose20。2.2试剂Ｔryptone,yeastextract购自Oxoid公司；IPTG,acrylamide,SDS,glycine,Tris购自Sigma公司；其余试剂均为国产试剂纯。2.3培养方法将-80℃15%甘油保存的菌种接种于含卡那霉素的LB固体培养基平板上培养过夜，取单菌落接种于含5mLLB液体培养基的25mL试管中,200r/min培养过夜后成为活化种子,以4%的接种量接入含50mL自诱导液体培养基的500mL锥形瓶中进行培养。2.4分析方法2.4.1菌体浓度分析1本课题得到福州大学校科技发展基金（2005-XQ-10）资助的。将培养液稀释一定倍数，测定600nm波长下的吸光度OD600，OD600=稀释倍数×吸光度[4]。2.4.2IL-7蛋白的表达取一定量的培养液以10000r/min离心5min后去上清，按文献[5，6]的方法进行SDS-PAGE，丙烯酰胺浓度为12.5%。2.4.3IL-7蛋白表达水平分析样品跑完SDS-PAGE电泳后用凝胶成像系统扫描凝胶，以牛血清白蛋白作为参比，通过凝胶成像系统分析软件分析目的蛋白的含量。2.4.4乳糖浓度分析取一定量的培养液以10000r/min离心5min后取上清液，将上清液通过酸水解后，取一定量水解液用葡萄糖试剂盒来测定。2.4.5乙酸的测定乙酸测定采用气相色谱法，取1ml上清液，加入0.2ml50%硫酸酸化，异戊醇作内标，15000r/min离心，取上清液5µL进样分析。3.实验结果3.1基因工程菌的自诱导培养研究3.1.1基因工程菌自诱导培养的生长代谢曲线在LB培养基中添加乳糖的BL21（DE3）基因工程菌的培养过程中，生物量逐渐增长，培养至12h时达到昀大值，随后进入生长稳定期。在IPTG诱导下（培养3h开始诱导），生物量也逐渐增加，诱导6h后达到昀大值。乳糖自诱导的昀终生物量可达到IPTG诱导水平的171%（图1），这表明培养基中添加IPTG对菌体产生了明显的毒性作用。基因工程菌的自诱导培养过程与乳糖消耗过程有着密切的联系(图2)。在起初的培养基中除了乳糖外还含有其它的碳源，由于乳糖的转运和利用受多种因素的影响，大肠杆菌首先利用了这些碳源。当自诱导培养基中的碳源越来越少，基因工程菌开始大量利用乳糖，菌体浓度大幅上升。乳糖自诱导的IL-7表达速度IPTG早，昀大的表达量是IPTG诱导昀高水平的1.17倍。实验说明乳糖自诱导可代替IPTG诱导表达IL-7蛋白达到较高的水平。0123456780123456789101112131415Time(h)OD600图1工程菌乳糖自诱导培养与IPTG诱导培养的生长比较(`:lactose;v:IPTG)Fig.1GrowthComparisonoftherecombinantmicroorganismwithIPTGandlactoseasinducer(h)Lactoseconcentration(g/L)在自诱导培养过程中，IL-7的表达随时间的变化如图3所示。从图中我们可以看到蛋白表达率在培养初期蛋白表达率较低，IL-7的表达水平随着时间的增大而变大。在培养初期，乳糖几乎没有利用，却实现了IL-7蛋白的表达；培养至7h，蛋白表达率昀高，IL-7的表达水平为0.55g/L。从7h至12h，蛋白表达水平有微小的下降，但都维持在0.5g/L以上；而在不含有乳糖的LB培养基中，没有得到明显的IL-7蛋白的诱导表达。实验说明乳糖自诱导表达IL-7蛋白可以达到较高的表达水平。00.10.20.30.40.50.60123456789101112131415Time(h)IL-7expressionlevel(g/L)图3IPTG诱导和乳糖自诱导基因重组菌表达IL-7的对比(@:lactose;v:IPTG)Fig.3IL-7expressioncomparisonbetweenIPTGandlactoseasinducer3.1.2基因工程菌乳糖自诱导培养的乙酸含量研究发现，当乙酸的浓度超过1.0-1.5g/L时重组外源基因的表达会大幅度降低[7]。在自诱导培养过程中，乙酸含量随培养时间的变化如图4所示。从图中可以看出乙酸含量随着培养时间的增加而变大，在培养至12h，乙酸含量达到了0.52g/L。在IPTG诱导下，培养至10h乙酸含量可达1.43g/L。实验说明用乳糖进行自诱导产生的乙酸含量不会抑制菌体的生长和蛋白的表达。这表明乳糖自诱导的方法可以适用于高密度培养基因工程菌。图2乳糖自诱导培养的乳糖含量Fig.2Theconcentrationoflactoseinlactoseauto-induction(h)Aceticacid(g/L)图4基因工程菌培养的乙酸含量(`:lactose;v:IPTG)Fig.4TheaceticacidconcentrationoflactoseandIPTGasinducer3.2影响乳糖自诱导培养的因素本工作进一步考察了乳糖浓度、接种量和溶解氧浓度、选择压力等因素对细菌生长和目标蛋白表达的影响。3.2.1乳糖浓度对细菌生长和目标蛋白表达的影响本实验采用了0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%不同的乳糖浓度，通过分析比较不同乳糖浓度自诱导对外源蛋白表达和菌体生长的影响，实验结果如图5所示。从图中可以发现生物量随着乳糖浓度的增大而提高，其中1.5%的乳糖浓度达到昀高的生物量，进一步增加乳糖浓度则会抑制基因重组菌的生长。从图中还可以发现不同乳糖浓度的蛋白表达水平没有显著的差异，基本维持在5g/L以上。024680.511.522.5Lactoseconcentration(%)OD60000.20.40.6IL-7expressionlevel(g/L)OD600IL-7图5不同乳糖浓度自诱导基因工程菌的生物量与蛋白表达Fig.5Effectofdifferentlactoseconcentrationontherecombinantproteinexpressionlevelandgrowthinauto-inductionmedium3.2.2接种量对细菌生长和目标蛋白表达的影响本实验采用了1%、2%、3%、4%、5%不同的接种量，分析其对外源蛋白表达和菌体生长的不同影响，实验结果如图6所示。从图中可以发现在不同的接种量下，细菌的生物量和目的蛋白的表达水平都没有显著的差异。实验结果表明在本实验范围内接种量对乳糖自诱导培养没有明显影响。0246812345Inoculumsconcentration(%)OD6000.000.200.400.60IL-7expressionlevel(g/L)OD600IL-7图6不同接种量自诱导基因工程菌的生物量与蛋白表达Fig.6Effectofdifferentinoculumsconcentrationontherecombinantproteinexpressionlevelandgrowthinauto-inductionmedium3.2.3溶解氧浓度对细菌生长和目标蛋白表达的影响本实验通过在培养瓶中控制不同的装液量控制培养过程的DO水平。在500ml三角瓶中分别加入25ml、50ml、75ml、100ml、125ml的自诱导培养基进行摇瓶培养。实验结果如图7所示。由图可见，装液量在25ml，50ml时，IL-7的表达量分别为5.17g/L和5.09g/L，装液量为75ml，100ml和125ml时，IL-7降为4.54g/L、4.13g/L和3.93g/L。与蛋白表达类似，生物量也是随着装液量的增多而降低。这表明溶解氧对于乳糖自诱导培养具有显著的影响。02468255075100125Mediumvolume(mL)OD60000.20.40.6IL-7expressionlevel(g/L)OD600IL-7图7不同溶解氧浓度自诱导基因工程菌的生物量与蛋白表达Fig.7EffectofdifferentDOconcentrationontherecombinantproteinexpressionlevelandgrowthinauto-inductionmedium3.2.4乳糖自诱导过程质粒稳定性的研究重组质粒在宿主细胞中的稳定性对发酵有重要影响。在培养基中添加选择性压力可以维持质粒的稳定性，一般通过加抗生素来维持质粒的稳定性。然而添加抗生素对于下游纯化工程增添了极高的难度，由于抗生素残留不但危害人民的身体健康，而且还影响我国农副产品的健康发展，目前国内外的药品食品的生产中都不允许添加抗生素，所以在发酵过程中添加抗生素来维持质粒稳定性的做法不适合于大规模生产。本实验尝试在无选择压力下进行乳糖自诱导培养，研究在无选择压力下重组菌的生长、蛋白表达和质粒稳定性。实验结果表明（表1），在不含抗生素的乳糖自诱导培养中，培养12h后OD600值可达9.68（有选择压力下OD600为7.20），IL-7蛋白表达水平为0.502g/L（有选择压力下蛋白表达水平为0.512g/L）。036912Antibiotics-freeAntibiotics00.20.40.6OD600IL-7图7抗生素对自诱导基因工程菌的生物量与蛋白表达的影响Fig.7Effectofadditionofantibioticsontherecombinantproteinexpressionlevelandgrowthinauto-inductionmedium4讨