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表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonancetechnology，SPR)刘闯、魏巍、乔艳、苏瑞锐简介•表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonancetechnology，SPR)是20世纪90年代发展起来的，应用SPR原理检测生物传感芯片(biosensorchip)上配位体与分析物作用的一种新技术。1900年:Wood就发现光波通过光栅后，光频谱发生了小区域的损失，这是关于表面等离子共振电磁场效应的最早记载。1909年：Sommerfeld从麦克斯韦的电磁理论出发，引入了复介电常数的概念，得到了局限在表面附近的电磁波的波解。1957年：Ritchie首次发现了金属等离子共振现象，为表面等离子共振仪的诞生提供了理论依据。20世纪60年代：Otto和Kretschmann等人研究了金属和介质界面用光学方法激发SPR的问题。分别设计了两种棱耦合方式。1990年：第一台商业制造的生物传感器诞生。1表面等离子共振原理1.1基本物理光学原理重点讲解消逝波的概念1.2等离子体的原理重点阐述等离子波的概念1.3SPR仪的光学原理1.1基本物理光学原理衰逝波的形成由菲涅尔定律：21=θθsinsin21nn可以看出，当（临界角）的情况下，即当入射角大于临界角时，透射波的空间相移为：cθθ1这表示沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波，这就是衰逝波。衰逝波最后仍返回第一介质，总的来说光的能量没有进第二介质。1.2等离子体的概念•等离子体通常是指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，内部不形成空间电荷。等离子振荡波•金属可以看成等离子体,由于电磁振荡形成等离子波•我们在前面提到光以大于临界角入射在光疏介质和光密介质表面时，会形成衰逝波进入到光疏介质中，而在介质（假设为金属介质）中又存在一定的本征等离子波。•当物质的本征波遇到外界波的时候可能会发生什么？举个共振的例子•18世纪中叶，一队士兵在指挥官的口令下，迈着威武雄壮、整齐划一的步伐，通过法国昂热市一座大桥，快走到桥中间时，桥梁突然发生强烈的颤动并且最终断裂坍塌，造成许多官兵和市民落入水中丧生。后经调查，造成这次惨剧的罪魁祸首，正是共振！因为大队士兵齐步走时，产生的一种频率正好与大桥的固有频率一致，使桥的振动加强，当它的振幅达到最大限度直至超过桥梁的抗压力时，桥就断裂了。类似的事件还发生在俄国和美国等地。有鉴于此，所以后来许多国家的军队都有这么一条规定：大队人马过桥时，要改齐走为便步走。1.3SPR仪的光学原理当入射波以某一角度或某一波长入射，近场波矢K和SPW的波矢相等，发生谐振，入射光能量耦合到SPW波，反射光强度出现一个凹陷。此时的入射光角度称为SPR角。SPR角随金表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。2.SPR仪的结构示意图及工作原理2.1Biacore3000的工作单元2.2温度控制2.3LED状态指示器2.4SPR仪的传感芯片（sensorchip）2.1Biacore3000的工作单元·两个液体传送泵：其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传感芯片表面，另一个泵负责自动进样装置中的样品传送。·自动上样装置(autosampler)：负责样品的混合、注射和回收。·一体化U型射流器（Integratedu-FluidicCartridge,IFC）：包含液体传送通道，样品环和阀门。·检测单元：包括能够产生和测量SPR信号的光电组分。·四个可探测的液体池(flowcell)：该液体池通过将IFC靠在传感芯片上而形成。·微处理装置(microprocessors)：它能控制泵，自动上样装置，和IFC的阀门并且能对SPR信号作基本的处理。Biacore3000的液体流路简图2.2温度控制SPR信号对于温度变化非常敏感Biacore3000采用Peltier元件来控制传感芯片的表面温度。如果温度不稳定，仪器前部面板上的黄色LED（light-emittingdiode）会不停的闪烁。通过预先设定，我们可以把温度控制在4-40ºC之间任意一点。2.3LED状态指示器2.4SPR仪的传感芯片（sensorchip）A.CM5传感芯片2.4.1几种芯片B.CM4传感芯片C.CM3传感芯片D.SA传感芯片E.NTA传感芯片F.HPA传感芯片G.L1传感芯片2.4.2配体与传感芯片的偶联方法（1）氨基偶联法OHCONOCOOOligandNHCOEDC/NHSNH2ligandOHCONOCOOOEDC/NHSNHCSSONNHCOSSligandPDEAligandSH（2）配体巯基偶连（3）醛基偶连法NHCONH2NHCONHCO1.EDC/NHS2.HydrazineligandCHONCHligandNaCNBH4OHCONHH2CligandSPR的核心是入射光的衰势波与介质表面的等离子波形成共振，只要能到达到共振就能有SPR现象产生，所以根据SPR激励原理，可以有4种分析方法:•1.角度调制法：固定入射光的波长，改变入射角度，观测到反射光的归一化强度•2.波长调制法：固定入射光的角度，改变入射光的波长，观测入射光的归一化强度•3.强度调制法：如射光的角度和波长都固定，凭借强度的变化测量折射率的变化•4.相位调制法：入射光的角度和波长都固定，观测反射光和入射光的相差。3.前沿发展•美国热电公司分子光谱部以其10年傅立叶变换红外技术经验结合最新的SPR技术推出了崭新的FT-SPR检测模块-SPR100，与角度扫描型SPR检测技术不同，SPR-100的特征是在SPR检测体系中固定入射光的角度，当在某一特定波长发生等离子共振现象时，入射的p-偏振光能量几乎被完全吸收，从而检测到金属表面分子间的相互作用。3.1波长调制•SPR生物传感器主要包括光波导藕合器件，金属膜，生物分子膜三个组成部分，所以说相应的技术方面的改进还是从这三个方面着手的。3.2光波导藕合器件•使光与表面电磁波发生藕合共振必然要用到光藕合成器件•最经典的用于衰减全反射的棱镜装置有Otto和Kretschmann型•采用Kretschmann型后，可选择棱镜几何形状一是直角等腰三角形，另一种是半球形。半球形可保证任何角度入射光均于界面垂直，反射光损失小，而且进入棱镜后的角度不变。•光纤藕合结构的SPR传感器采用光纤作为光的传输媒质。由于光纤的特殊性，这种传感器具有其他结构所没有的特点：它可以很方便地探测一些人类难以进入或者有害的地方，可以通过光线对敏感信号的传输，实现远程检测和分布式检测，而且也可以达到较高的灵敏度。光纤藕合传感器一般是将普通光纤部分保护层剥离，将纤芯裸露出来，再在纤芯外包裹金属膜层及敏感层，检测时，将该部分与样液接触。•光纤藕合结构•1987年Tiefenthaler等人提出了衍射光栅作为光波藕合元件的SPR生物传感器•Homola等人分析比较了衍射光栅耦合法和棱镜耦合法的灵敏度。以波长作为变量时，棱镜耦合法的灵敏度高玉衍射光栅耦合法，以角度作为变量时，棱镜耦合法与平面衍射光栅耦合法具有相似的灵敏度，但采用曲面衍射光栅耦合法则可提供很高的信噪比，获得很高的灵敏度。3.3金属膜SPR的金属膜由传统的金膜发展到现在金膜和银膜作为最常用的两种金属膜。银膜具有很高的反射率和较高的测量灵敏度，稳定性高于金膜，是SPR首选的金属膜。金膜的稳定性最好，具有较强的化学惰性，尤其适用银膜不能使用的体系。从SPR光谱的三个特征参数（共振波长，共振宽度，共振深度）来看，在同样的条件下，银膜的共振波长的变化明显比金膜灵敏，共振深度约大于金膜，共振峰宽明显小于金膜。4.特点与传统的相互作用技术如超速离心，荧光法，热量测定法等相比，SPR生物传感器具有如下显著特点：•1实时检测,能动态地监测生物分子相互作用的全过程•2无需标记样品，保持了分子活性•3样品需要极少，一般一个表面仅需要1毫克蛋白•4检测过程方便快捷，灵敏度高•5应用范围非常广泛•6高通量，高质量的分析数据•7能跟踪监控固定的配体的稳定性•8对复合物的定量测定不干扰反应的平衡•9大多数情况下,不需要对样品进行处理•10由于SPR基于对未穿透样品的反射光的测量,所以能在混浊的甚至不透明的样品中进行.•基于以上特点，在实际工作中，有以下应用：SPR应用物理学应用若某种物理量会引起特定敏感膜折射率的变化，就可以采用SPR传感技术进行检测。例如，基于温度变化引起特定敏感膜的吸湿量变化，并导致其折射率变化，从而利用SPR传感技术进行检测的湿度传感系统，以及基于氢化无定型硅的热光效应的温度传感系统等。化学应用待测分子被敏感膜有选择性地化学吸附或与敏感膜中的特定分子发生化学反应，引起敏感膜的光学属性（主要是折射率）的变化，从而会导致引起表面等离子共振条件的变化。因此可以通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成分、浓度以及参与化学反应的特性。例如：应用SPR测定葡萄糖溶液浓度葡萄糖的SPR反射光谱不同浓度的葡萄糖溶液的共振波长生物学应用分子生物学领域免疫学领域药物领域微生物领域食品工业领域临床医学领域分子生物学领域•DNA复制•转录调控•蛋白质间相互作用•核酸之间、核酸与蛋白质间的相互作用•酶促反应检测•生物小分子检测•酶促反应检测检测反应的动态过程曲线HBsAg样品的SPR光谱图不同浓度的HBsAg溶液的响应曲线•乙肝表面抗原测定免疫学领域免疫传感的放大检测利用链霉亲和素-生物素系统对传感片表面键合的反应物质量大幅度增加，实现对免疫传感相应信号的放大。药物领域药物筛选与新药开发药物与蛋白之间的相互作用1mmol/L的头孢克洛与HSA作用的SPR光谱(B)头孢菌素类药物与人血清白蛋白之间的相互作用不同浓度的头孢克洛(a)和头孢曲松(b)与共振电压位移的关系曲线食品工业领域•维生素检测•生物毒素检测•细菌和病原菌检测•农、兽药残留量检测临床医学领域临床检验SPR技术证明系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中含有C4bBP，它与PS结合并阻断后者的抗凝血作用，揭示了SLE患者常伴有血栓发生的机理。利用SPR技术在胞外环境中研究控制基因转录、细胞周期、细胞分裂和凋亡的信号传递途径，从而可以准确地设计出这些生化作用催化剂的拮抗物，应用于癌症的治疗。前景与展望SPR传感技术的发展趋势SPR传感技术具有无可比拟的优势，它在很多领域都具有广阔的应用前景。然而现有的SPR传感技术与传统分析手段相比，特别是与免疫检测手段相比，在检测成本、易用性、稳定性、检测效率以及灵敏度等方面还存在一些不足。这就决定了该技术今后几年的主要发展趋势。进一步提高检测灵敏度及分辨率实现多通道检测器件微型化和阵列化降低检测成本展望在生物化学、免疫学、微生物检测、药物筛选及研发、环境污染的控制、医学诊断、食品及药物检测、工业遥感等方面都有不俗的表现。SPR生物传感器经过20年来的发展,已经成为生命科学和制药领域的一种重要的研究工具。随着SPR技术成为科研中的一个不可缺少的部分,SPR生物传感器的应用将更加趋向多样化,特别是它在小分子检测和脂膜领域的新兴应用将使其在未来的药物发现和膜生物学中扮演一个越来越重要的角色。总之，由于表面等离子共振仪实时、动态、免标记、灵敏等特点使它在生物医学领域的应用越来越广泛。在这种技术的推动下，在各个学科共同合作下，新的科研技术和手段会不断涌现，生命科学会再次走向辉煌。