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实验2培养基制备技术目的要求1.掌握培养基制备的基本过程。2．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。器材和试剂1.试剂牛肉膏、氯化钠、蛋白陈、琼脂粉、抗凝绵羊血、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、硝酸钾、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、硫酸亚铁、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、酚红、lmol/LNaOH、lmol/LHCl。2.器材5OOml锥形瓶、5OOml量筒、lOml、5ml和1ml吸管、精密pH试纸、华氏试管、硅胶塞、天平、高压蒸气锅、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。步骤和方法1.培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。(1)调配成分:按培养基组成准确称取各成分用量，放人锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。(2)溶解:将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸气灭菌器中，使其完全溶解。不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中含铜量超过0.3mg/L时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生。(3)矫正pH:一般将培养基的pH凋至7.2～7.6左右。经高压灭菌后其pH可发生0.1～0.2变动。若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.l～0.2；若用NaCO3矫正，高压灭菌后pH升高0.1一0.2。(4)滤过澄清:自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。(5)分装:1）基础培养基:一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；2）琼脂斜面:通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有lcm柱高；3）半固体培养基:分装量为试管容量的1/4～1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；4）琼脂高层培养基:分装量为管长的2/3(接种厌氧菌用)，灭菌后趁热直立凝固；5）琼脂平板无菌分注:先将灭菌琼脂熔化后冷却至5O0C左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径90mm的平皿约13～15ml)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置40C保存备用。(6)灭菌:1)由耐热物质配制成的培养基(如普通营养琼脂等)常用高压蒸气灭菌，条件为103.43kPa，l5～2Omin；含糖培养基以68.95kPa，l0～l5min为宜，以免破坏糖类物质。2)不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸气灭菌，方法是加温80～100C3Omin，每天一次，连续3天。3)富含蛋白质的培养基(如含血清或鸡蛋清的培养基需用血清凝固器灭菌，方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内(一般做成斜面)，第一天750C3Omin，第二天800C3Omin，第三天850C3Omin。在三次灭菌的间隙将培养基取出置350C孵箱中过夜。(7)质量检验:需做无菌试验和效果试验。1）无菌试验:将灭菌后的培养基置350C孵育24h，无任何细菌生长为合格；2）效果试验:将已知的标准参考菌株接种于待检培养基中。检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。(8)保存:制备好的培养基应注明名称、制作日期，如琼脂平板应将底(带培养基的平面)朝上，盖在下;用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发。液体培养基应直立放置。制作好的培养基应存放于冷暗处或40C冰箱。2.常用培养基的制备(1)肉汤:将新鲜牛肉(去除筋和脂肪)5009绞碎加水。40C过夜。加热45～500Clh，用数层纱布或滤纸过滤，加水补充至1OOOml。再加入蛋白胨lOg和NaCl5g加热熔化，冷至40～500C。矫王pH至7.4一7.6。分装于锥形瓶或试管内，加塞后高压蒸气灭菌；103.43kPa2Omin。冷后放阴暗处或40C备用。供作无糖基础培养基用。适用于营养要求一般的细菌。(2)肉膏汤:将牛肉膏3g、蛋白陈lOg。NaCl5g、蒸馏水l0OOml置锥形瓶或大容量烧杯中，加热熔化后矫证pH至7.6，煮沸3～5min，过滤后分装，高压灭菌103.43kPa2Omin后。40C贮存。供作无糖培养基用，适庙营养要求一般的细菌。(3)普通琼脂(营养琼脂):将肉汤或肉膏汤1000ml、琼脂20g混合，加热熔化，调pH至7.6，趁热分装试管或锥形瓶，加塞后高压灭菌103.43kPa2Omin,取出试管摆成斜面，待琼脂凝固后即成琼脂斜面；锥形瓶中的琼脂冷至5O0C左右倾注灭菌平皿，凝固后即成普通琼脂平板。供一般细菌培养用，可作无糖基础培养基。（4）半固体培养基:将肉汤或肉汤膏1000ml(已调pH至7.6，下同)，琼脂5g混合,加热熔化后凋pH至7.6，分装小试管，每管2ml，加塞，高压灭菌103.43kPa2Omin，取出后直立待凝即成。可作观察细菌动力和保存菌种用。(5)血液和巧克力琼脂培养基:将灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热熔化，冷至5O0C左右。以无菌操作加入无菌脱纤维羊血(临用前置370C水浴预温30min)。轻轻摇匀(避免产生气泡)，分装于无菌试管和平皿内，凝固后即成血液琼脂斜面和血液琼脂平板。若在琼脂温度800C时加入血液。并在800C水浴中摇匀3Omin，倾注平板后即成为巧克力琼脂平板。血液琼脂用于分离培养和保存营养要求高的细菌；巧克力琼脂主要用于分离培养奈瑟菌属、嗜血杆菌属、肺炎链球菌等苛养菌。注意事项1．培养基的澄清如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法。其方法为:取一个蛋的卵蛋白加水2Oml，搅拌至出现泡沫，倒入l0OOml液体或熔化的固体培养基中混匀。然后在流动蒸气中加热30～6Omin，使培养基中不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后以纱布夹脱脂棉(固体培养基)或滤纸(液体或半固体培养基)过滤即可。2．平板的浇注倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物的落入。倾注时若培养基温度过高，冷凝水过多，易致污染。不易分离到菌落；若温度过低，部分琼脂凝固，倾注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后。将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝。这样便于蒸气散发，减少平板内冷凝水。倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，倾注时应适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。