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微生物学与微生物检验实验指导医学技术系微生物与免疫检验教研室微生物学与微生物检验实验的目的要求1．通过实验来验证理论，使课堂效果更为生动，学到的知识更为巩固。2．通过学生亲自动手操作，得到比较全面的微生物学基本操作技术的训练。3．在微生物学实验课的过程中，帮助学生建立无菌观念，掌握无菌操作技术。4．帮助学生熟悉和掌握常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法以及各种临床标本的微生物学检查的基本程序。5．在实验过程中培养学生独立操作、独立思考、分析问题和解决问题的能力。微生物学实验室规则及注意事项一、微生物学实验室规则在进行微生物学实验时，须时刻牢记实验的对象是病原微生物，任何疏忽都可能导致严重的后果，不仅自身有可能被感染，而且有可能将病原微生物传给他人。因此决不能有丝毫侥幸心理，冒任何不必要的危险。迸入实验室时必须遵守下列规则。1．进实验室时必须穿自大衣，离室时脱下反折，白大衣要经常清洗消毒。2．每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒药水泡手。3．书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具、实验指导、笔记等带入后，放在指定的地方。4．每次实验后均用消毒药水擦洗工作台面，并用紫外线灯照射过夜。5．在实验室内不准吃东西、喝饮料和吸烟，不可把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。6．进入实验室后要保持安静，禁止高声谈话，不准打闹嘻笑。7．必须按照老师指定的方法，小心地处理传染性材料、培养物和污染的物质，要正确地使用存放污染器材的各种消毒容器。8．接种环使用前后必须进行烧灼灭菌。9．必须小心地避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告老师，以便及时作适当处理。10．培养物和传染性材料须放在工作台的安全部位，尽可能保持台面的清洁整齐。11．爱护公物，合理使用实验材料和器材，如不慎损坏了某些器具，应及时报告老师，听候处理。12．实验完毕后值日生清理台面，将需培养的标本及时放入培养箱，并打扫地面，关闭水、电、煤气和门窗，带课教师检查合格后方可离开实验室。二、实验室意外的紧急处理办法1．皮肤破损先除去异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂2%红汞或2%碘酒。2．烧伤局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。3．化学药品腐蚀伤若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤中和；强碱腐蚀伤时先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和。若受伤处是眼部，经过上述步骤处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1一2滴。4．菌液误人口中应立即吐入消毒容器内，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口；并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。5．菌液流洒桌面将适量2%一3%来苏尔或0.1%新洁儿灭倒于污染面，浸泡半小时后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。6．火警如发生火警疫情时须沉着处理，切勿慌张，应立即关闭电闸和煤气阀门。如酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭火苗。三、实验时的注意事项(一)严格遵循实验指导1．在开始做实验以前，须仔细阅读实验指导，进行独立思考，并根据实际情况，作出实验的具体安排和打算。2.合理安排时间和实验材料，尽量避免出错，力求取得理想的结果。(二)认真完成实验操作1．认真听取指导老师实验前的讲解。2．细心操作，若发现问题，在独立思考分析原因的基础上找老师帮助。3．在自己的实验材料上作好标记，包括班级、姓名、菌名、日期等。4．认真观察自己的实验结果，将其记录在实验报告中（根据需要用彩色笔绘图记录)，并回答实验报告中所有的问题。5．遇到实验结果与理论不符的情况，应仔细分析原因，培养自己独立思考、分析问题和解决问题的能力。实验1细菌涂片的制备和革兰染色目的要求1．掌握革兰染色的原理、方法；2．熟悉细菌涂片的制备。3．学会在在显微镜下观察和描述细菌。器材和试剂1．菌种葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌。2．试剂革兰染色液、生理盐水、擦镜液。3、光学显微镜、载玻片步骤和方法1．涂片制备(1)涂片:取一张洁净载玻片，将大肠杆菌液体培养物直接涂布于载玻片。或先在载玻片上放置一接种环生理盐水，再取固体培养基上少许葡萄球菌或蜡样芽孢杆菌与生理盐水磨匀。涂成lcm×lcm大小的区域，取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色为宜。(2)干燥:涂片最好在室温下自然干燥，或将标本片接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可放在火焰上烧干。(3)固定:干燥后的标本片迅速通过火焰3次。这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉。2．革兰染色（1）原理:1)革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质食量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2)革兰阳性菌等电点(pI2～3)比革兰例性菌(pI4～5)低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固;不易脱色。3）革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。(2)方法:1）初染：滴加结晶紫2～3滴于涂布细菌处，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。2)媒染:滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。3)脱色:滴加95%乙醇数滴。轻轻晃动玻片;使玻片上流下的乙醇液无紫色为止，大约30秒左右(灵活掌握时间)，用流水冲洗，用于。4）复染:滴加稀释石炭酸复红液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油。然后用油镜观察；染色结果:葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性菌，呈葡萄状排列的球菌；变形杆菌染成红色，为革兰阴性菌，单个散在分布的杆菌。影响因素：一是操作因素，涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时应避免菌体过分受热。二是染液因素;所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使乙醇浓度降低而增强脱色能力。三是细菌因素，不同时间的细菌培养物，染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老龄菌染成红色。细菌染色一般用18一24h的细菌培养物。附录革兰染色液配制1．结晶紫染液:称取结晶紫4～8g，溶于100ml95%乙醇中制成饱和液。取20ml饱和液80ml10g/L草酸铵溶液混合即成，过滤后备用。2.卢戈(Lugol)碘液:先将2g碘化钾溶于I0ml蒸馏水中，再加1g碘，待碘全部溶解后再加300ml蒸馏水即成。3.95%乙醇或丙酮乙醇溶液(70m195%乙醇加3Oml丙酮)。4.稀释石炭酸复红液:称取4g碱性复红溶解于100m195%乙醇内，即成碱性复红饱和酒精溶液，吸取lOml饱和液和90m」50g/L石炭酸水溶液混匀即成石炭酸复红液。量取10ml石炭酸复红液加90ml蒸馏水混匀即成。实验2培养基制备技术目的要求1.掌握培养基制备的基本过程。2．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。器材和试剂1.试剂牛肉膏、氯化钠、蛋白陈、琼脂粉、抗凝绵羊血、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、葡萄糖、乳糖、甘露醇、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、硝酸钾、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、硫酸亚铁、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中性红、酚红、lmol/LNaOH、lmol/LHCl。2.器材5OOml锥形瓶、5OOml量筒、lOml、5ml和1ml吸管、精密pH试纸、华氏试管、硅胶塞、天平、高压蒸气锅、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。步骤和方法1.培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。(1)调配成分:按培养基组成准确称取各成分用量，放人锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。(2)溶解:将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸气灭菌器中，使其完全溶解。不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中含铜量超过0.3mg/L时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生。(3)矫正pH:一般将培养基的pH凋至7.2～7.6左右。经高压灭菌后其pH可发生0.1～0.2变动。若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.l～0.2；若用NaCO3矫正，高压灭菌后pH升高0.1一0.2。(4)滤过澄清:自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。(5)分装:1）基础培养基:一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；2）琼脂斜面:通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有lcm柱高；3）半固体培养基:分装量为试管容量的1/4～1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；4）琼脂高层培养基:分装量为管长的2/3(接种厌氧菌用)，灭菌后趁热直立凝固；5）琼脂平板无菌分注:先将灭菌琼脂熔化后冷却至5O0C左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内(内径90mm的平皿约13～15ml)，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置40C保存备用。(6)灭菌:1)由耐热物质配制成的培养基(如普通营养琼脂等)常用高压蒸气灭菌，条件为103.43kPa，l5～2Omin；含糖培养基以68.95kPa，l0～l5min为宜，以免破坏糖类物质。2)不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸气灭菌，方法是加温80～100C3Omin，每天一次，连续3天。3)富含蛋白质的培养基(如含血清或鸡蛋清的培养基需用血清凝固器灭菌，方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内(一般做成斜面)，第一天750C3Omin，第二天800C3Omin，第三天850C3Omin。在三次灭菌的间隙将培养基取出置350C孵箱中过夜。(7)质量检验:需做无菌试验和效果试验。1）无菌试验:将灭菌后的培养基置350C孵育24h，无任何细菌生长为合格；2）效果试验:将已知的标准参考菌株接种于待检培养基中。检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。(8)保存:制备好的培养基应注明名称、制作日期，如琼脂平板应将底(带培养基的平面)朝上，盖在下;用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发。液体培养基应直立放置。制作好的培养基应存放于冷暗处或40C冰箱。2.常用培养基的制备(1)肉汤:将新鲜牛肉(去除筋和脂肪)5009绞碎加水。40C过夜。加热45～500Clh，用数层纱布或滤纸过滤，加水补充至1OOOml。再加入蛋白胨lOg和NaCl5g加热熔化，冷至40～500C。矫王pH至7.4一7.6。分装于锥形瓶或试管内，加塞后高压蒸气灭菌；103.43kPa2Omin。冷后放阴暗处或40C备用。供作无糖基础培养基用。适用于营养要求一般的细菌。(2)肉膏汤:将牛肉膏3g、蛋白陈lOg。NaCl5g、蒸馏水l0OOml置锥形瓶或大容量烧杯中，加热熔化后矫证pH至7.6，煮沸3～5min，过滤后分装，高压灭菌103.43kPa2Omin后。40C贮存。供作无糖培养基用，适庙营养要求一般的细菌。(3)普通琼脂(营养琼脂):将肉汤或肉膏汤1000ml、琼脂20g混合，加热熔化，调pH至7.6，趁热分装试管或锥形瓶，加塞后高压灭菌103.43kPa2Omin,取出试管摆成斜面，待琼脂凝固后即成琼脂斜面；锥形瓶中的琼脂冷至5O0C左右倾注灭菌平皿，凝固后即成普通琼脂平板。供一般细菌培养用，可作无糖基础培养基。（4）半固体培养基:将肉汤或肉汤膏1000ml(已调pH至7.6，下同)，琼脂5g混合,加热熔化后凋pH至7.6，分装小试管，每管2ml，加塞，高压灭菌103.43kPa2Omin，取出后直立待凝即成。可作观察细菌动力和保存菌种用。(5)血液和巧克力琼脂培养基:将灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热熔化，冷至5O0C左右。以无菌操作加入无菌脱纤