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实验4肉中沙门氏菌的检测目的要求1、掌握沙门氏菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及检验程序2、掌握沙门氏菌的血清学鉴定方法器材和试剂1．标本变质肉2．培养基及试剂缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿増菌液、亚硫酸盐胱氨酸増菌液、伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板、动力吲哚尿素培养基、柠檬酸盐培养基、尿素培养基、克氏双糖铁培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、甲基红试剂、VP试剂、硝酸盐培养基及A、B试剂、沙门菌O及H因子单价血清、3%过氧化氢溶液。3．其他高压灭菌器、恒温培养箱、接种环、接种针、载玻片、革兰染液、生理盐水。步骤和方法1、标本采集及运送：（1）采样是食品检验中的一个重要环节，所采样品应具有代表性。（2）采样必须用灭菌器具，严格执行无菌操作。（3）样品可分为大、中和小样三类。大样指一整批食品；中样指从样品各部分随机抽的混合样品，以200g为准；小样指做分析用的检样，以25g为准。食品微生物检验一般取小样。（4）根据食品的种类采取不同的采样方法。如固体粉末和液体混合后取样；袋、罐、瓶装食品应取未开封的完整体；冷冻食品在冷冻状态取样，非冷冻食品需在0-5℃保存。（5）样品采集后应立即送检，一般不应超过3h。2、检验方法：食品中沙门菌的检验方法有四个基本步骤：即前增菌或选择性增菌；选择性平板分离沙门菌；生化试验鉴定到属；血清学分型鉴定。（1）增菌培养：将标本25g加入装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶中。固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃±1℃培养4h，移取10ml，转接种在100ml氯化镁孔雀绿増菌液或四硫酸钠煌绿増菌液内，36±1℃培养18-24h.鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必进行前增菌。直接取样25g（25ml）加入灭菌生理盐水25ml，按前述方法制成匀液，取25ml接种于100m亚硫酸盐胱氨酸増菌液内，36℃±1℃培养18-24h.（2）分离：取増菌液分别接种到伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板，36℃±1℃培养18-24h.（3）菌落观察：由于本菌不分解乳糖并产碱，所以在SS琼脂和麦康凯平板上形成无色或淡黄色、半透明、圆形、凸起、边缘整齐的光滑湿润小菌落。产H2S的菌株可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。（4）生化反应1）氧化酶试验：取氧化酶纸片，刮取SS琼脂上的较大的菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性，不变为阴性为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。沙门氏菌氧化酶试验为阴性。2）初步试验鉴定：将沙门氏菌分别接种在克氏双糖铁琼脂、动力吲哚尿素培养基、葡萄糖蛋白胨水管和硝酸盐培养基管中，经35℃孵育18-24h后，加入相应试剂，观察结果。同时做触酶试验。结果见表1表1沙门氏菌的基本生化反应KIAMIU硝酸盐氧化酶触酶还原斜面底层产气H2S动力吲哚脲酶伤寒沙门菌KA-+/-+---++甲型副伤寒KA+-/++---++乙型副伤寒KA+++---++氧化酶试验原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。甲基红试验的原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至4．5以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。V-P试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性动力靛基质尿素酶培养基原理：制备的动力靛基质尿素酶培养基除加有200g/L尿素和酚红指示剂外，其蛋白胨较原克利斯顿森尿素培养基提高10倍，并制成半固体培养基，以便观察细菌的动力。由于蛋白胨中含有丰富的色氨酸，产生色氨酸酶的细菌可以水解色氨酸形成靛基质，当加入靛基质试剂后形成玫瑰吲哚。产生玫瑰红色为阳性。产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产碱，使酚红指示剂显桃红色。因此，该试验可同时观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的活性，故简称为MIU试验过氧化氢酶试验原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮。（5）沙门氏菌的血清学分型鉴定：待检菌形态、培养、生化反应疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先用A-F群多价诊断血清作玻片凝集试验，在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验（伤寒和丙型副伤寒沙门菌具有Vi抗原），若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，100℃水浴15min（破坏Vi抗原），再与A-F群多价“O”诊断血清做凝集试验。若与A-F群多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌”O”单价因子血清分别作玻片凝集试验，以确定该菌株属于的群别。一般先选用本地区检出率最高血清型的相应血清作玻片凝集反应。若已确定是何种血清型沙门菌，再分别用H因子血清先检查第一相抗原，然后检查第二相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。结果报告：综合上述生化和血清学试验的结果，对食品中沙门菌做出菌型判断，并报告结果。注意事项：1、严格遵守无菌操作规范。2、采样注意代表性、采样后立即送检。3、挑选典型菌落进行生化反应。4、血清学试验中取菌量要适宜，保证抗原-抗体的最佳比例。附录1．糖发酵培养基肉汤膏（pH7.4～7.6）100ml糖0.5～1g16g/L溴甲酚紫乙醇溶液0.1m1将上述成分溶解后，分装试管。经55.16kPa高压灭菌l5min。如需观察产气，可于每试管中加小倒管一支；如加入的糖为双糖必须灭菌后加入培养基内。2．尿素培养基蛋白陈1g氯化钠5g葡萄糖1g尿素20g磷酸二氢钾2g2g/L酚红液6m1蒸馏水1000m1以上各成分(除尿素外)加热溶解，调整pH至6.8，以68.95kPa灭菌l5min后，以无菌操作加入已过滤除菌的尿素溶液，混匀后分装试管，置40C冰箱保存备用。3．克氏双糖铁复合培养基蛋白胨20g牛肉膏3g酵母膏3g乳糖10g葡萄糖1g氯化钠5g柠檬酸铁铰0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂12～15g49/酚红水溶液6m1蒸馏水1000m1除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正pH至7.4～7.6，再加入糖类和酚红水溶液，混匀，过滤分装，每管3m1，68.95kPa灭菌l5min，取出后制成斜面。