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实验5金黄色葡萄球菌的检测目的要求1、掌握金黄色葡萄球菌检测的基本程序2、熟悉金黄色葡萄球菌检测的基本方法与步骤。器材和试剂1．样品可疑奶粉2．培养基及试剂普通营养琼脂平板、血琼脂平板、却普曼琼脂平板、7.5%NaCl肉汤培养基、甘露醇发酵管（微）、甲苯胺蓝DNA琼脂平板、葡萄糖微量发酵管、新鲜抗凝血浆（人或兔）。3．其他接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法一、检验程序1：10奶粉稀释液7.5%NaCl肉汤增菌直接计数血平板和却普曼琼脂平板观察菌落特征，革兰染色镜检血浆凝固酶试验、甘露醇试验耐热核酸酶试验、肠毒素测定等二、检验方法1、样品的采取和送检（1）散装或大型包装的乳品检样：用灭菌刀、勺取样。在移采另一件样品前，应将用过的刀、勺清洗灭菌。采样时应注意不同的部位、使样品有代表性。样品仿品放入灭菌器内，及时送检。(2)小型包装的乳品检样：应采取整件包装，奶粉1瓶或1包。采样时应注意包装的完整性。（3）成批产品质量的检样：采样量一般以1‰的比率抽取，应注意代表性，不足千件者抽取1件。2、检样处理（1）罐（瓶）装乳粉：将罐或瓶表面先用温水洗净，再用点燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上表面，然后用灭菌的开罐器打开罐或瓶面，以无菌手续称取25g检样，放入装有玻璃珠的三角烧瓶内，然后徐徐加入225ml温热的灭菌生理盐水，（先加少许使乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块）。振摇均匀，使充分溶解后即为1：10稀释液。（2）袋装乳粉：可用75%的酒精棉球擦拭消毒袋口后，以无菌手续开封取样。以后操作同罐（瓶）装乳粉。3、增菌培养：用无菌吸管吸取上述稀释液5ml加入7.5%NaCl肉汤或胰酪胨大豆肉汤45ml培养基内，置37℃温箱培养24h。再肉汤中呈浑浊生长，胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。4、分离培养：直接取可疑奶粉或增菌培养物划线接种至血平板或却普曼琼脂平板，经37℃孵育18-24h后观察菌落。取可疑菌落做革兰染色镜检。根据形态染色特性，然后进一步做生化反应鉴定。5、生化反应（1）触酶试验：本试验用于初步区别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性，后者为阴性。（2）血浆凝固酶试验：1）原理：致病性葡萄球菌产生的一种能凝固人和兔血浆的蛋白质。可分为两种：结合型血浆凝固酶直接作用于血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离型凝固酶，作用类似凝血酶原，可被人或兔血浆中协同因子激活变成凝固酶样物质，使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白，进而使血浆凝固，可用试管法测出。2）方法：玻片法：取人或兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的破片上，挑取可疑菌落分别与血浆和盐水混合；试管法：取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆和生理盐水，挑取被检菌分别加入血浆中并混匀，于370C水浴3-4小时3）结果判断、解释和报告：玻片法以血浆中有明显颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性，反之，细菌在血浆中呈均匀混浊则为阴性；试管法以血浆凝固判为阳性，反之，试管内血浆不凝固仍流动的，则为阴性。若阴性，应继续观察到24h，仍不凝固者为阴性。4）临床意义：血浆凝固酶试验被广泛用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其它葡萄球菌，常作为鉴定葡萄球菌致病性的主要依据之一，金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（3）耐热核酸酶测定：1）原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，能将DNA水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。水解后的DNA短链与甲苯胺蓝结合，使甲苯胺蓝DNA琼脂显示粉红色。非致病性葡萄球菌虽然也能产生DNA酶，但不耐热。因此耐热DNA酶测定可作为鉴定致病性葡萄球菌的重要指标。2）方法：玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上6～8个孔径2～5mm的小孔，各孔分别加1滴经沸水浴3min处理过的待检菌和阳性、阴性对照葡萄球菌培养物，37℃孵育3h，观察有无粉红色圈及其大小。平板法：在已形成葡萄球菌菌落的平板上挑选待检菌并做好标记，置60℃烤箱加热2h（使不耐热的DNA酶灭活），取出后平板上倾注10ml已预先融化的甲苯胺蓝DNA琼脂，37℃孵育3h，观察菌落周围有无粉红色圈。划线刺中法：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种划线刺中于甲苯胺蓝DNA琼脂平板上，37℃±1℃培养24小时，观察刺中线周围有无淡粉红色出现。3）结果判断、解释和报告：玻片法孔外出现粉红色圈的为阳性；平板法葡萄球菌菌落周围有无粉红色圈的为阳性。金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（4）甘露醇发酵试验：1）原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变为黄色。2)方法：将待检菌分别接种于两支甘露醇发酵管，其中一支滴加灭菌的液体石蜡（不低于1cm）,35℃培养18～24小时后观察结果。3）结果判断、解释和报告：两支培养基均混浊，由紫色变为黄色为甘露醇发酵试验阳性，两支都为紫色或只有一支变为黄色为阴性。金黄色葡萄球菌的本试验为阳性，表皮和腐生葡萄球菌为阴性。（5）肠毒素测定：1）琼脂扩散试验：金黄色葡萄球菌肠毒素与肠毒素抗血清在琼脂板上可形成白色沉淀线。2）ELISA法：利用双抗体夹心法，测定标本中金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。3)动物试验：金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是一种耐热性蛋白质，通常在100℃30min不被破坏，注入动物后可产生食物中毒的症状。结果报告：综合上述试验的结果，对食品是否污染金黄色葡萄球菌做出判断，并报告结果。