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实验6蜡样芽孢杆菌的检测目的要求1、掌握蜡样芽孢杆菌检测的主要步骤和方法。2、掌握蜡样芽孢杆菌菌落的观察方法和生化反应结果的判断。器材和试剂1．样本：变质剩米饭2．培养基及试剂普通营养琼脂平板、血琼脂平板、卵黄琼脂平板、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露醇微量发酵管、蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸橼酸盐培养基，明胶培养基。吲哚试剂、VP试剂、鞭毛染色液、3%过氧化氢3．其他接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法1.样品的保存与送检：待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在-20℃，检验前再于室温下解冻，脱水食品可在室温下送检和储存。2.样品的制备（1）用无菌操作的方法称取可疑食品50g放于无菌均质杯中。（2）加450ml无菌磷酸盐缓冲液于均质杯中以18000-20000r/min离心，2min，制成1：10样品稀释液。（3）取1：10稀释液10ml加到含有90ml无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1：100的稀释液。（4）每个稀释度换用1支10ml灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-6.3．活菌计数取各稀释度的悬液0.1ml接种于卵黄琼脂平板上。以灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面，每个稀释度接种2个卵黄琼脂平板。置35℃培养6小时，本菌在此平板上产生乳光反应，易于识别。选取菌落数在30左右的平板进行计数。计数后从中挑取5个可疑菌落进一步做证实试验。根据证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平皿内的蜡样芽孢数，然后乘上稀释倍数即得每克样品中所含蜡样芽孢杆菌数。如10-4稀释液的平皿内菌落数为25个，取5个鉴定，其中4个证实为该菌，则1克检样中的蜡样芽孢杆菌数为：25×4／5×104×10=2×1062)倾注平板计数法：同消毒灭菌。一般认为蜡样芽孢杆菌每毫升或每克食物中的活菌数大于105时，即有可能发生食物中毒。4.形态观察：将平板上的可疑菌落进行涂片革兰染色可见革兰阳性大杆菌、两端稍钝圆、多数呈链状排列，少数有单个、成双或不规则排列。卵圆形的芽孢位于菌体中央或次极端，不突出菌体。鞭毛染色可见有周鞭毛，无荚膜。5.菌落观察：将可疑食物或培养物加适量生理盐水研磨后划线接种于普通营养琼脂平板和血琼脂平板上，经35℃孵育18-24h后观察菌落。在普通营养琼脂平板上形成圆形、凸起、表面粗糙、边缘呈扩散状、不透明的菌落，应光看呈白蜡状；在血琼脂平板上出现的菌落呈浅灰色似毛玻璃状外观，并有明显的草绿色或透明的溶血环。在卵黄琼脂平板上由于产生卵磷脂酶分解培养基中的卵磷脂，菌落周围形成乳白色混浊环。6.生化反应（1）碳水化合物试验：将普通营养琼脂平板和血琼脂平板上的单个可疑菌落分别接种到葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、微量发酵管和葡萄糖蛋白胨水，枸橼酸盐培养基上，35℃孵育18-24h后观察结果。该菌能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不分解乳糖、甘露醇、木糖，不产生吲哚，触酶、VP试验阳性。枸橼酸盐利用试验阳性。（2）含氮化合物试验：将可疑菌落分别接种到明胶培养基，经35℃孵育18-24h后观察结果。该菌可液化明胶。（3）乳光反应：1）原理：本菌能产生卵磷脂酶，在有Ca2+存在时，能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱，故在菌落周围出现乳白色混浊环，称乳光反应或卵黄反应。2）方法：用接种针挑取可以菌落点种在10%卵黄琼脂平板上，35℃孵育3h。3）结果和意义：3h无菌落生长，但在点种处可出现混浊环，6h后混浊环直径可扩大至5-6mm。用于测定细菌能否产生卵磷脂酶，也可以此来计数菌落。（4）触酶试验：阳性7.肠毒素测定：通过动物实验测定。本菌与枯草芽孢杆菌的不同点是不分解木糖，与炭疽芽孢杆菌的不同点是能迅速液化明胶，利用枸橼酸盐。附录10%卵黄琼脂（1）成分：50%卵黄盐水20ml，pH7.4营养琼脂100ml（2）配置方法：将营养琼脂加热熔化，待冷却至55℃左右，以无菌技术加入50%卵黄盐水悬液，混匀后倾注于无菌平皿内，凝固后置4℃备用。（3）用途：用于测定蜡样芽孢杆菌的脂酶。