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实验7铜绿假单胞菌的检测目的要求1、掌握铜绿假单胞菌检测的主要步骤与方法。2、熟悉化妆品标本的采集原则。3、掌握铜绿假单胞菌菌落的观察和生化反应结果的判断。器材和试剂1．样本可疑化妆品2．培养基及试剂SCDLP液体培养基、普通营养琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯平板、KIA、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、明胶培养基、麦芽糖、木糖微量发酵管、硝酸盐培养基、枸橼酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水、肉汤培养基等。1%盐酸二甲基对苯二胺（氧化酶试剂）、硝酸盐还原试剂、吲哚试剂、3%过氧化氢、氯仿、1mol/L的盐酸3．其他接种环、接种针、载玻片、革兰染液、香柏油、擦镜液、生理盐水。步骤和方法一、样品的前处理1.亲水性样品（水包油型）：可取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水中，如样品量少于10ml，仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10稀释液。2.疏水性样品（油包水型）：取样品10g先加10ml灭菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40-44℃水中振荡混匀10min，加入灭菌生理盐水75ml，在40-44℃水浴中乳化，制成1：10悬液。或用均质器，将加有助溶剂、稀释液的样品放入均质器，均质3-5min后，取上清液待检（上清液的稀释倍数为1：10）。3.膏、霜、乳剂半固体状样品1）亲水性样品取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32℃水浴中静置15min，用其上清液作为1：10的稀释液。2）疏水性样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40-44℃水浴中充分混匀，制成1：10稀释液。4.固体样品：取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放30-32℃水浴中静置15min后取出，充分振荡混匀，再放到30-32℃水浴中静置15min，取上清液作为1：10的稀释液。如有均质器，上述亲水性膏、霜、乳剂等，可称10g样品加90ml的灭菌生理盐水，均质1-2mi；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加90mlSCDLP液体培养基，或1g样品加1ml灭菌液体石蜡、1ml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3-5min。二、增菌培养：取1：10稀释样品10ml加入90mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养18-24h，进行增菌。如有铜绿假单胞菌生长，则培养基表面有一薄层菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。三、分离培养：从増菌液的菌膜处挑去培养物，划线接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板、十六烷三甲基溴化铵平板和血琼脂平板上，经35孵育18-24h后观察菌落特征及色素等。本菌为专性需氧菌，在普通营养琼脂平板上形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、光滑、湿润而常呈融合状态的菌落，琼脂被染成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、有生姜味的灰绿色或蓝绿色菌落，菌落周围出现的菌落呈有透明的溶血环。在麦康凯平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕绿色。十六烷三甲基溴化铵平板具有较强的选择性，大肠埃希氏菌不能生长，革兰阳性菌生长较差而铜绿假单胞菌则生成无定型扁平菌落，向周边扩散或略有蔓延、表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。四、形态观察：将可疑菌落进行涂片革兰染色可见革兰阴性球杆状或长丝状，成双或成链排列。不染色标本动力观察，运动活跃；鞭毛染色，一端有1-3根红色的鞭毛。五、生化反应：将上述几个平板上的可疑菌落接种到各种生化培养基中。1.氧化酶、触酶试验、本菌均阳性。2.绿脓菌素提取试验：本来应该用专门的绿脓菌素培养基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化铵平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化铵平板，具体方法为在十六烷三甲基溴化铵平板中加入3-5ml氯仿，轻轻振摇2分钟左右，当氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移至另一试管中，并加入1mol/L的盐酸1ml左右，震荡片刻后静止，如上层盐酸层液内出现粉红色为阳性，表明有绿脓菌素的存在。3.42℃生长试验：挑去纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放41-42℃培养箱中，培养24-48h。铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。4.其他生化反应：铜绿假单胞菌的最后鉴定，主要根据生化反应特征，与嗜麦芽窄食单胞菌的生化区别如下表1。铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌主要生化反应结果KIA氧化酶枸橼酸盐硝酸盐产氮吲哚色素葡萄糖麦芽糖木糖细菌底层斜面产气H2S铜绿假单胞菌----+++-++-+嗜麦芽窄食单胞菌----+----++-检验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，可报告被检样品中检出有铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性，而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。