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实验9血凝和血凝抑制实验实习目的及意义一、掌握血细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的原理。二、熟悉流感病毒的分离鉴定程序。三、了解血细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的方法和结果分析。实验仪器设备及试剂一、材料标本：流感病毒悬液（新分离病毒之羊水或鸡胚尿囊培养液）、流感病人血清、0.5%鸡红细胞悬液、流感病毒型（A、B、C型）及甲型流感病毒亚型（抗A1、抗A2、抗A3）诊断血清、生理盐水。二、器具：试管、试管架、吸管、U型塑料反应板等。实验基本要求一、试验用红细胞为SRBC或人O型红细胞，新鲜红细胞致敏不宜长期保存。实际应用最好用醛化红细胞致敏，致敏后冷冻干燥可长时间保存。二、不同批的致敏血细胞之间重复性差，解决的方法是一次做大量的醛化红细胞备用，减少批次的转换，同时加强质量控制。三、在试验中所用的病毒应灭活，以防传染。四、试验用的血凝板、试管等器材必须十分清洁，否则易造成假阳性。五、试验时一定要有阳性和阴性对照，以保证结果准确可靠。必要时可做凝集抑制试验，以确定凝集的特异性。操作步骤一、血细胞凝集试验：（一）流感病毒的分离鉴定程序2-1可疑病人早期(前3天)的含漱液、鼻腔洗液、咽喉拭子等（经青、链霉素处理过夜）鸡胚培养（接种到羊膜腔或尿囊腔）330C～340C72h用收获的羊水或尿囊液作血细胞凝集试验进一步用血细胞凝集抑制试验盲传两代鸡胚仍为阴性或补体结合试验定型时报告阴性图2-1流感病毒的分离鉴定程序（二）原理:流感病毒表面有一种糖蛋白的血凝素(HA),能与人及一些哺乳动物的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集，其不属于抗原抗体的特异性凝集。据此原理而建立的血凝试验可用来测试病毒体的存在，也可用于病毒的鉴定。（三）方法1、取10只清洗干净的小试管，按表2-1所示在各管加入生理盐水，其中第1管为0.9ml，其它各管均加0.25ml。2、取新分离的流感病毒悬液0.1ml，加入第1管中作1：10的稀释，混匀后吸取0.5ml弃之，再吸取0.25ml(1:10)稀释液加至第2管混匀，即为1:20的稀释，从第2管取出0.25ml加至第3管混匀，……依次作倍比稀释至第9管取出0.25ml弃之。这样，各管的液体量均为0.25ml，从第1到第9管的稀释度为1:10，1:20，1:40…1:2560，第10管为生理盐水对照。3、倍比稀释后，每管加入0.5%的鸡红细胞悬液0.25ml，轻轻摇匀后置室温，45min后观察结果。表6-8流感病毒血细胞凝集试验的加样顺序表(单位:ml)123456789生理盐水0.90.250.250.250.250.250.250.250.25病毒液0.10.250.250.250.250.250.250.25(弃0.5)(弃0.25)病毒稀释度1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280对照0.5%鸡红细胞各管加0.25ml摇匀后，室温静置45min结果举例4+4+3+2+2+++--结果分析和报告1、结果的观察和判断标准：观察结果是一定要轻拿轻放，各管中红细胞凝集程度不同，用-、+、2+、3+、4+表示，以出现“2+”的最高病毒稀释液作为血凝效价（滴度），即1个血凝单位。4+：一层红细胞全部均匀铺于管底，无红细胞沉积。3+：大部分红细胞凝集呈薄层均匀平铺底部，但有少数细胞沉于管底中心形成一个小红点。2+：约有半数红细胞凝集在管底并铺成一个环状，四周有小凝集块。+：多数红细胞在管底沉积成圆点，少数凝集的红细胞散在周围形成小凝快。-：无红细胞凝集，红细胞沉于管底形成边缘整齐光滑的致密圆点。2、结果报告按举例的结果，流感病毒的血凝效价（滴度）为1:160，即病毒稀释至1:160时，每0.25ml病毒稀释液中含1个血凝单位，配制成含有4个血凝单位时，病毒液应稀释成1：40。如果血凝试验为阳性，则做血凝抑制试验进行进一步的证实，并可确定流感病毒的型和亚型。二、血细胞凝集抑制试验（一）原理：流感病毒悬液中加入特异的抗血清后，再加入人“O”型、鸡或豚鼠的红细胞就不会再发生血凝现象，即为血凝抑制。在该试验中若病毒的抗血清是已知的，则可鉴定该病毒的型与亚型，此为定性试验；相反，若病毒是已知的，则可测定患者血清中有无相应的抗体，此为定量试验。操作时应先将病人血清进行处理，目的是除去血清中非特异性抑制物或凝集素，并要求取患病初期和恢复期的双份血清作两次试验，只有恢复期血清抗体效价比初期高4倍以上，才有诊断意义。（二）定性试验1、先在U型反应板上选择7个孔并排好序号。2、4个血凝单位的流感病毒悬液分别加入上述7孔内，每孔两滴（100微升）。然后在1、2孔上分别加入流感病毒A型、B型的诊断血清，3、4、5孔分别加入抗A1、抗A2、抗A3的诊断血清，6孔加鸡血清、7孔加生理盐水，以上各孔加量均为2滴，加完后轻轻晃动，使所加试剂充分混匀，放置5min后再进行下面操作。3、上述7孔中分别加入0.5%鸡红细胞2滴轻轻摇动反应板使各孔内容物混匀，室温静置50min左右后观察结果。结果分析和报告：凡出现明显血凝现象的反应孔，即全部或大部分红细胞凝集平铺孔底，无红细胞沉积或有少量红细胞沉积于中心，为血凝抑制试验阴性。而未出现血凝现象或血凝现象不明显的试验孔，即血细胞沉积于孔底形成边缘整齐光滑小圆点者，周围可有少量凝集的红细胞散在，就可判断新分离病毒与该孔所用诊断血清的型或亚型相一致。（三）定量试验1、先将患者血清用霍乱液处理以除去血清中非特异性抑制物。2、再将血清作倍比稀释，取洁净试管10只，编号后排于试管架上，其中第1至第7管为试验管，第8管为病毒对照，第9管为血清对照，第10管为鸡红细胞对照。3、在10只试管中分别0.25ml生理盐水。4、取经过处理的患者血清1：5的稀释液0.25ml,加入第1管中形成1:10的稀释液，混匀后取0.25ml加至第2管，照此依次作倍比稀释，至第7管为止。5、在第1至第8管中分别加入流感病毒悬液0.25ml（每0.25ml含4个血凝单位），9、10管为血清对照管和红细胞对照管，所以不加流感病毒悬液（混匀后置370C2h作用后，效果更佳）。6、最后在每管中加入0.5%鸡红细胞0.5ml，轻轻摇动后放置室温，45min后观察结果。（表2-2）。结果分析和报告观察血凝的判断标准与血细胞凝集试验相同。但不同的是，本试验是以不出现血凝现象为阳性，凡呈现完全凝集抑制（血细胞不凝集）的试管中，其血清的最高稀释度作为血凝抑制效价。临床意义间接血凝试验在临床检验中应用广泛，主要用于以下几个方面。1、用于临床诊断。2、检测抗病原生物抗体，也可用于检测自身抗体，如抗核抗体、类风湿因子等。3、用于病毒的分型鉴定。4、反向间接血凝试验常用于检测血中乙肝表面抗原和甲胎蛋白等。表2-2流感病毒血细胞凝集抑制试验(单位:ml)89101234567病毒血清红细胞对照对照对照生理盐水0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.251﹕5病0.250.250.250.250.250.250.25000人血清病人血清1:101:201:401:801:1601:3201:640稀释度4单位病0.250.250.250.250.250.250.250.2500毒抗原5%鸡红细胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5思考题1、细胞凝集抑制试验的原理是什么？2、细胞凝集试验和血细胞凝集抑制试验的注意事项是什么？