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第五讲分子生物学基本研究法从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。DNA操作技术基因克隆的常用载体系统基因的分离与鉴定。5.1重组DNA技术发展史上的重大事件三大成就：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。表5-1重组DNA技术史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1959-1960Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码；Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密码。1967第一次发现DNA连接酶1970Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶，Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与Maxam和Gilbert等人发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦昀高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和Brinster获得转基因小鼠，Spradling和Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素，Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986GMO首次在环境中释放。1988Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定（(1.15×108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定(2.7×109bp)。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。图5-3重组DNA操作过程示意图。表5-2重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团5.2DNA操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表5-3琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。5.2.2核酸的分子杂交将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。由于该方法是E.M.Southern首先设计出来的，所以又叫做Southernblotting。在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。图5-6Southern凝胶转移杂交技术图5-7用荧光法检测核酸杂交信号5.2.3细菌转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。图5-8λ噬菌体作为克隆载体5.2.4核苷酸序列分析1、Sanger双脱氧链终止法Sanger等人于1977年发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，该法有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶的两种酶催反应特性：能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链；能够利用2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物，将其掺入到寡核苷酸链的3'-末端，从而终止DNA链的生长。图5-9脱氧核苷三磷酸（dNTP）和双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的分子结构式。DNA合成中，5’→3’磷酸二酯键的形成需要3’-OH参与，因此ddNTP的掺入会导致DNA链合成的终止。图5-10Sanger双脱氧链终止DNA序列分析法原理。每个反应中都加入一种不同的ddNTP和全部4种dNTP，其中一种带有35P同位素标记。反应混合物样品加到聚丙烯酰胺胶中，进行电泳分离。电泳凝胶用X光底片作放射自显影曝光，产生出可见的谱带。从胶的底部开始判读谱带，逐渐读向顶部。所得的核苷酸序列是同模板链碱基序列互补的。图中*号表示带有放射性同位素标记的核苷酸。2、Maxam-Gilbert化学修饰法：用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，特异性切割碱基，产生一组各种不同长度的DNA片段的混合物，经电泳分离和放射自显影之后，根据X光片上所显现的相应谱带，判定DNA序列。在碱性的条件下，肼（hydrazine，又叫联氨，NH2·NH2）能够从C4和/或C6原子位置作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基，环化形成新的5原子环。有六氢吡啶（piperidine）存在时，通过β-消除反应，释放2个磷酸分子并在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果加入1mol/L浓度的盐，那么联氨同胸腺嘧啶的反应速率便会明显下降，发生胞嘧啶特异的化学切割反应。硫酸二甲酯是一种碱性的化学试剂，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。在中性pH条件下，鸟嘌呤和腺嘌呤残基上的甲基化足以导致配糖键发生水解，DNA链断裂。加入六氢吡啶后，就只在G而不是A残基上发生DNA链的断裂。在酸性环境中，因嘌呤碱基的质子化作用（protonation）导致脱嘌呤效应，会使配糖键发生水解，再经过六氢吡啶催化的β-消除作用移去磷酸分子，于是就会在这个位点上发生DNA链的断裂。这一反应是嘌呤碱基特异的。图5-11Maxam-Gilbert化学修饰法原理。(a)用T4多核苷酸激酶标记DNA限制片段的5‘-末端，或用T4DNA聚合酶标记其3’-末端；(b)将32P-末端标记的DNA片段分成4个反应试管，进行化学切割反应；(c)将反应物加到聚丙烯酰胺序列胶上，进行电泳分离，经放射自显影后在X光底片上显现出可判读的谱带。3、DNA序列分析的自动化包括两个方面：即“分析反应”的自动化和“读片过程”的自动化，后者是问题的关键。现在大多采用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光，从而取代同位素标记。在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道小孔，在凝胶板的上面装荧光信号接收器。当DNA条带在电场的作用下经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA受激