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第2章遗传图绘制结构基因组的研究策略为何要绘制遗传图与物理图？1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位置组装,需要图譜进行指导.2)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图.3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.什么是遗传图?遗传图(GeneticMap):通过遗传学方法,以遗传图距(cM)为单位绘制的染色体上基因或标记之间相对位置的连锁图.遗传图与物理图1）遗传作图（Geneticmapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM),每单位厘摩定义为1%交换率。2）物理作图（Physicalmapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种（radiationhybrid）作图的计算单位为厘镭(cR),限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp,kb)。基因组测序的策略---由上至下(左)和由下至上的测序(右)全基因组鸟枪法测序和基于克隆物理图的测序都必须要有高密度的分子标记.为何要用分子标记进行基因组作图基因组测序的基本策略是将整个基因组分割成一些小的片段分别测序,然后将测序的片段进行组装,使其回归到原来的位置.为了确保分散的基因片段正确归位组装,必须寻找一批标记,它们在染色体上的位置是已知的、唯一的、确定的,并位于不同的测序片段之中.基因组路标(landmarker)标记1标记2标记3染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标,路标具有物理属性,它们由特定的DNA顺序组成.路标位于染色体上的位置是固定的,唯一的,不会更改的,因而提供了作图的依据座位(locus)与位点(site)Locus:座位是经典遗传学中常用的概念,系指染色体上经遗传分析确定的某个位置,它们可以是基因、DNA顺序或分子标记.因此locus系指遗传单元在染色体所占据的位置.Site:位点是指基因组物理图上某一确定的DNA顺序.注:当locus是指确定的DNA顺序或基因序列时,也可称为site.遗传作图标记1)第一代分子标记,单一顺序多态性:RFLP,AFLP,RAPD2)第二代分子标记,重复顺序多态性:Simplesequencelengthpolymorphisrns,SSLPsVariablenumberoftandemrepeats,VNTRSimpletandemrepeats,STRSinglesequencerepeats,SSR3)第三代分子标记,单核苷酸多态性:Singlenucleotidepolymorphisms,SNP第一代分子标记---RFLPRFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism限制性片段长度多态性最早发现的DNA分子标记--RFLPRFLP是如何想到的?1978年,在犹他州盐湖城滑雪胜地艾尔塔的一场例行的学术讨论中,从事经典人类遗传学研究的专家与从事分子生物学研究的专家进行学术交流.分子生物学家从经典遗传学的研究中获得灵感.BotsteinD,WhiteRL,SkolnickM,DavisRWDavidBotsteinDavidBotstein是首先提出RFLP想法的科学家.PRINCETON,N.J.--PrincetonUniversityhasnamedDavidBotstein,arenownedgeneticist,educatorandpioneeroftheHumanGenomeProject,asthenewdirectoroftheLewis-SiglerInstituteforIntegrativeGenomics.BotsteinwillsucceedShirleyM.Tilghman,whowasthefoundingdirectoroftheinstituteandbecamepresidentoftheUniversityin2001,andJamesBroach,whoisinterimdirector.Botstein'sappointmentwillbeginJuly1,2003.一篇只有想法而无实验的论文BotsteinD,WhiteRL,SkolnickM,DavisRW(1980)Constructionofageneticlinkagemapinmanusingrestrictionfragmentlengthpolymorphisms.AmJHumGenet32:314–331这是一篇在基因组研究中具有里程碑意义的论文第1篇有关人类RFLP实验论文AHighlyPolymorphicLocusinHumanDNAArleneR.WymanandRayWhite,MITAlocusinthehumangenome,notassociatedwithanyspecificgene,hasbeenfoundtobeasiteofrestrictionfragmentlengthpolymorphism.Thepolymorphismwasfoundbyhybridizinga16-kilobase-pairsegmentofsingle-copyhumanDNA,selectedfromthehumangenomelibraryclonedinphageCH4A,toaSoutherntransferoftotalhumanDNAdigestedwithEcoRI.DNAsfromanumberofindividualsfromwithinMormonpedigreesaswellasrandomindividualshavebeenexamined.Thelocusishighlyvariable,withatleasteightallelespresent,homozygotesaccountingforlessthan25%oftheindividualsexamined.---PNAS|November1,1980|vol.77|no.11|6754-6758最早涉及RFLP的论文1)BotsteinD,WhiteRL,SkolnickM,DavisRW(1980)Constructionofageneticlinkagemapinmanusingrestrictionfragmentlengthpolymorphisms.AmJHumGenet32:314–331[PubMed]2.GusellaJF,WexlerNS,ConneallyPM,NaylorSL,AndersonMA,TanziRE,WatkinsPC,OttinaK,WallaceMR,SakaguchiAY,YoungAB,ShoulsonI,BonillaE,MartinJB(1983)PolymorphicDNAmarkergeneticallylinkedtoHuntington’sdisease.Nature306:234–238[PubMed]doi:10.1038/306234a0.3.KnowltonRG,Cohen-HaguenauerO,VanCongN,FrezalJ,BrownVA,BarkerD,BramanJC,SchummJW,TsuiLC,BuchwaldM,Donis-KellerH(1985)ApolymorphicDNAmarkerlinkedtocysticfibrosisislocatedonchromosome7.Nature318:380–382[PubMed]doi:10.1038/318380a0.RFLP多态性的产生与检测(1)子代两个亲本基因型,两个重组基因型.RFLP多态性的产生与检测(2)亲子代RFLP多态性的检测RFLP的特点1)处于染色体上的位置相对固定;2)同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变;3)同一凝胶电泳可显示等位区段不同多态性片段,表现为共显性.4)需要用Southern杂交检测显示.如何寻找RFLP标记1)随机克隆筛选;2)将其它方法获得的DNA标记,如RAPD(randomamplifiedpolymorphismDNA)标记转换为RFLP标记;3)从cDNA中寻找RFLP.4)计算机筛选,即电子杂交.AFLP(amplifiedfragmentlenthpolymorphism,放大的片段长度多态性)1)这是一种筛选RFLP分子标记的方法.先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI,Sau3A)消化,然后加上接头PCR引物.2)接头PCR引物设计:根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基,然后向3’方向延伸1-3个不同的碱基.3)选择不同的引物对扩放样品DNA,经聚丙烯胺凝胶电泳分离标记的PCR产物.AFLP的操作程序不同品系基因组AFLP扩放图第二代分子标记---SSR1)可变排列的简单重复顺序,即重复次数不一,在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同;2)SSR的类型:小卫星序列(minisatellite),重复单位较长微卫星序列(micrisatellite),重复单位较短,注:在1-6个核苷酸之间,是常用的分子标记.微卫星序列（SSR）如何寻找微卫星序列标记?1)1982年Hamada等首次报道microsatrllite现象(PNAS,79:6564,1982)2)1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中,有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化(Am.J.Hum.Genet.,44:388,1989).3)现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28kb含有一个多态性(CA)n.4)获取方法:a)机算机搜寻;b)用Sau3A,RsaI,HaeIII或AluI限制酶酶切基因组DNA,构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.5)根据简单重复顺序两侧的序列设计引物,用同位素标记PCR扩增样品,经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.如何检测SSR第三代分子标记---SNPSNP的一些特点1)SNP由核苷酸代换产生.2)人类基因组平均600bp含一个SNP.3)人类基因组SNP总量大于500万.占人类DNA顺序差异的10%-50%.4)基因组中一些紧密连锁的SNP可组成单倍型(Haplotype).单倍型中不同的SNP位点之间不发生重组与交换.人类不同群体中存在的SNP1.Thehaplotypepatternsfor20independentgloballydiversechromosomesdefinedby147commonhumanchr21SNPsspanning106kbofgenomicsequence.2.EachrowrepresentsanSNP.Bluebox=major,yellow=minorallele.Eachcolumnrepresentsasinglechromosome.3.The147SNPsaredividedinto18blocksdefinedbyblacklines.TheexpandedboxontherightisanSNPblockof26SNPsover4.19kbofgenomicDNA.The4Mostcommonof7differentHaplotypesinclude80%ofthechromosomes,andcanbedistinguishedwith2SNPs.Figure2ofPatiletal如何检测SNPSNP检测的实验手段经典方法采用PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析、RFLP、dHPLC和HA等，必须通过凝胶电泳等进行分析.高通量检测SNP的技术方法，如MALDI-TOF、DNAChip以及DNA测序、动态特异等位基因杂交（dynamicallele-specifichybridization).多态性组成频率(PIC)1)杂合