复旦基因组学课件11基因组的复制

第11章基因组的复制1原核生物基因组的复制2真核生物核基因组的复制3细胞器基因组的复制5复制的调控DNA复制的起始1)复制子—复制的单位2)复制起始点3)DNA双链的解旋4)复制起始复合物的组装5)复制起始与终止复制子（replicon）复制子是DNA的复制单位,由复制起始点,复制顺序和复制终点组成.1）大肠杆菌染色体为一个复制子；2）啤酒酵母基因组约有300个复制起始点,每40kbDNA组成一个复制子；3）人类基因组有20,000个复制起始点,每150kb一个复制子。细菌与酵母复制起始点的分离将大肠杆菌质粒复制起始点切除,然后用相同的限制酶处理染色体DNA.将缺少复制起始点的载体DNA与染色体片段连接转化,阳性克隆即含有复制起始点.大肠杆菌oriC的结构与功能DnaA蛋白与OriC位置的9bp重复顺序结合,并以消耗ATP的形式弯曲DNA.弯曲DNA产生的扭曲力促使富含AT的13bp重复顺序解链.暴露的单链DNA与SSB(单链结合蛋白)结合,形成复制泡.DNA复制时解旋单链的维持复制速率1)原核生物DNA复制速率约500bp/s;2)真核生物DNA复制速率约40-50bp/s.真核生物DNA复制速率约为原核生物DNA复制速率的1/10.大肠杆菌基因组复制起始位点与终止位点大肠杆菌染色体复制终止与分离大肠杆菌DNA复制的终止细菌质粒复制拷贝数的调控1)细菌质粒的拷贝数有两种:单拷贝,多拷贝.2)细菌质粒的复制利用的装置与染色体DNA的复制是相同的,但质粒的复制独立于染色体..3)细菌质粒拷贝的控制有相对独立的调控机制.4)质粒的非兼容性调控与拷贝数调控有两种不同的机制:反义RNA和重复子(iteron).5)染色体DNA复制是双向复制,质粒DNA复制是单向复制.非兼容性质粒复制调控1.Incompatibilitygroup:asetofplasmidsthatareunabletocoexistinthesamebacterialcell.Bothplasmidshavethesametypeoforigin.Copynumberiscontrolled:repressor(RNAI)thatmeasurestheconcentrationoforigins.2.ColE1plasmidasamodelforcopynumberandcompatibilitysystem.(ca.20copiespercell).Selfishplasmidswithterritorialrights(自私质粒具有领土主权).Plasmidincompatibilityisconnectedwithcopynumber非兼容性质粒复制抑制的机制:1.PrimerRNA:555bases,startsupstreamoftheoriandextendsintotheori.a.cleavedbyRNaseH(cutsRNA:DNAhybrids)b.3’OHofRNAservesasprimertoinitiateDNAsynthesis.c.onlycutbyRNaseHifitisnotduplexedwithantisenseRNA(RNAI)originP-IIP-IReplicationofColE1plasmidDNA-multicopycontrol;ReplicationstartswithtranscriptionRNAIRNAIIAnti-senseRNAI(108b)actsasanegativeregulatorRNAIIisrequiredforprimingDNAsynthesisattheorigin.Positiveregulation.P-IandP-IIarepromotersfortheregulatorytranscripts.-555-20RNApolymerase启动子II启动子IoriginP-IIReplicationofColE1plasmidDNA-multicopycontrolRNAII555-205’3’RNA-loopstructureisrequiredtostabilizetheRNA:DNApersistenthybrid.RNaseHcreatesthe3’-terminusifloopsarepresent.P--265originP-IIReplicationofColE1plasmidDNA-multicopycontrolRNAII-555-205’3’RNAIIservesasprimerforDNAsynthesisforreplication.P-IReplicase-265originP-IIReplicationofColE1plasmidDNA-multicopycontrolRNAII-555-20Withoutloops,RNAIIisnotabletoformapersistenthybridattheorigin.P-IRNAIDNAsynthesiscannotproceedwithoutastableprimer3’Noreplicationbuttranscriptioncontinues5’质粒拷贝数自主调控RNAIinitiationoftranscriptionproceedsasmuchasfivetimesmoreoftenthantranscriptionofRNAII.Asaconsequenceonlyoneoutofabout20RNAIImoleculesthatareinitiatedresultsinaproductiveDNAreplication.Rom蛋白可与RNAII的茎干结合,使其稳定,可提高复制起始.也可与RNAI和RNAII双链结合,降低RNAII的起始效率.F质粒单拷贝复制调控DnaAbox:DnaA蛋白结合区.A/T:富A/T区.13mer:OriC区13bp同源序列.DR:顺式重复顺序,与repE蛋白结合,使双链DNA分开.IR:反向重复顺序,顺序与DR一致.incC:拷贝数控制区.ori2:质粒复制起始点.sopA,B,C:参与质粒分配到子细胞.P/O:启动子/操纵基因.repE为复制蛋白,单体时可与DR重复顺序结合起始复制.repE在二聚体时与IR结合,抑制复制起始和转录.F质粒复制拷贝的自主调控F质粒单拷贝调控的两种模型:A,重复子模型;B,手拷模型.A.自然状态下RepE蛋白质趋向形成二聚体.在Rep基因转录合成RepE蛋白质的早期,主要是单体状态.随着RepE蛋白质的增加,二聚体RepE出现,并在复制起始点下游与DNA结合,阻止复制叉前进.B.ori2和inC共同调控F质粒的复制,维持单拷贝或低拷贝数,handcuffing酵母基因组复制起始点-ARS1)酵母复制起始点又称为ARS(autonomouslyreplicationsequence).2)酵母复制起始点含4个亚功能区:A和B1:ORC(OriginRecognitionComplex,起始识别复合物)识别顺序(originrecognitionsequence),为复制调控区.B2:与大肠杆菌oriC中的13bp类似,起始解链区.B3:ABF1因子结合位置,产生扭曲力,促使B2解链.酵母ARS的功能Adomain(coreconsensus)ORCTranscriptionfactorABF1enhancesinitiation-促使解链BdomainsimperfectconsensusB2-解链区B1B3ORC与MCM的关系ARS:autonomouslyreplicationsequence,酵母的ARS含有11bp的保守顺序,即ACS(ARSconsensussequence).ORC:Aproteincomplex,consistingofsixsubunits,servesasaeukaryoticDNA-synthesisinitiationfactor:theOriginRecognitionComplex(ORC).ORCbindstoACSinanenergydependentmanner.GeneticstudieshaveshowthattheORCisrequiredforDNAreplication.MCM:Minichromosomemaintenanceproteins(MCMs),可在ORC的作用下进入复制起始点,与DNA双链的退旋有关.MCM促使DNA双链退旋MCM与DNA复制高等生物复制起始点1）哺乳动物基因组也有复制起始点，但不能在大肠杆菌中起始复制，组成细节不明；2）已经分离到玉米基因组复制起始点，可在大肠杆菌中起始复制，结构类似低等生物ARS。3)迄今为止尚未从高等真核生物中分离到结构清楚,功能明确的复制起始点.真核生物DNA多聚酶成员外切核酸活性功能3’→5’(校读)5’→3’——————————————————————————————————DNA多聚酶α－－合成引物（RNA和DNA）DNA多聚酶β－－DNA修复DNA多聚酶γ+？线粒体DNA复制DNA多聚酶δ+－主要复制酶DNA多聚酶ε+？DNA复制，确切功能不明—————————————————————————————————真核生物DNA复制延伸真核生物DNA复制涉及三个酶:1)DNA聚合酶α,引物合成;2)DNA聚合酶δ,复制DNA单链;3)FEN-1,具RNA酶活性,切除引物.真核生物冈畸片段复制1）细菌中冈畸片段长度在10002000核苷酸之间。2）真核生物中，冈畸片段要短得多，少于200个核苷酸。这一点很有意义，因为其长度与缠绕核小体和连接核小体间区的DNA长度大致相同，可能每一轮冈畸片段的合成均以核小体为单位（核小体缠绕DNA长140150bp，连接核心颗粒的DNA长度5070bp）。真核生物DNA复制叉上的事件真核生物DNA复制中引物清除需要FEN-1PCNA:proliferaingcellnuclearantigen,增殖细胞核抗原.RP-A:真核DNA单链结合蛋白.FEN-1:flapendonuclease,侧向内切核酸酶.FEN1不能从5’酶切RNA引物真核生物DNA复制中引物清除过程1)真核生物由DNA多聚酶α合成引物,引物为RNA-DNA;2)DNA多聚酶δ缺少5’→3’外切核酸酶活性,不能切除引物;3)引物含RNA和DNA,DNA引物也需切除,由FEN1执行.很少知道真核生物复制终止的事件1）真核生物中与细菌类似的终止顺序以及Tus蛋白迄今尚未分离到，很有可能真核的复制叉是随机相遇的。2）真核生物的复制复合物是不解体的，因为复制场是细胞核中持久的结构成分。3）有一个更加困难的问题是，真核细胞核中合成的子链分子如何解决相互缠绕的问题。一般认为缠绕的DNA分子可能保持在很小的范围内，采取断裂重接方式回归原位。有人设想，每个复制场都只复制单个DNA，使子链分子有序排列而不至于彼此纠缠，但这些猜测还缺少证据。端粒复制的问题1)延滞链3‘端最外侧的顺序无法拷贝，因为最后一段冈畸片段不能合成引物，其引物的位点按规律应在模板链之外。末端冈畸片段的丢失意味着延滞链的拷贝要比模板链短一些。当它们作为亲代模板进行下一轮复制时，子链分子就会比祖代链在端部缺失一段顺序。2）引导链也有第一个起始RNA引物如何除去的问题，因为采取标准的方法切除已有的RNA引物必须在5’-方向有一段冈畸片段存在，而这实际上是没有的。即使末端RNA引物保留的到下一轮复制也不能作为DNA多聚酶复制的模板，因此末端RNA引物同样造成复制的子链5'端缺失。端粒DNA复制的问题（图解）端粒DNA的分离策略酵母染色体端粒的分离端粒DNA的顺序组成不同真核生物染色体端粒的组成：物种端粒重复顺序端粒酶RNA模板顺序——————————————————————————------------人类5’-TTAGGG-3’5’-CTAACCC