复旦生物化学课件7-蛋白质化学5-结构与功能及研究方法

蛋白质的结构与功能为什么研究蛋白质的结构与功能•对蛋白质结构和作用机理的深层次理解•对蛋白质结构进行改造的基础•对蛋白质功能的控制•“随心所欲”创造具有新功能的蛋白质蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基(β亚基N端的第6号Glu残基)发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变。蛋白质的一级结构与功能的关系•由较短肽链组成的蛋白质一级结构，其结构不同，生物功能也不同.•由较长肽链组成的蛋白质一级结构中，其中“关键”部分结构相同，其功能也相同；“关键”部分改变，其功能也随之改变。①一级结构是空间构象的基础蛋白质一级结构决定空间构象，即一级结构是高级结构形成的基础。只有具有高级结构的蛋白质才能表现生物学功能。实际上很多蛋白质的一级结构并不是决定蛋白质空间构象的惟一因素。除一级结构、溶液环境外，大多数蛋白质的正确折叠还需要其他分子的帮助。这些参与新生肽折叠的分子，一类是分子伴侣，另一类是折叠酶。②一级结构是功能的基础一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象和功能也相似。相似的一级结构具有相似的功能，不同的结构具有不同的功能，即一级结构决定生物学功能。③蛋白质一级结构的种属差异与分子进化从蛋白质氨基酸的序列可以了解到重要的生物进化信息。对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异。蛋白质一定的结构执行一定的功能，功能不同的蛋白质总是有不同的序列。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生变化。④蛋白质的一级结构与分子病蛋白质的氨基酸序列改变可以引起疾病，人类有很多种分子病已被查明是某种蛋白质缺乏或异常。这些缺损的蛋白质可能仅仅有一个氨基酸异常-分子病。同源蛋白质(不同生物中行使相同或相似功能的蛋白质）一级结构的种属差异性细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性（相似性）越大。不同生物与人的细胞色素C相比较，AA差异数目黑猩猩0鸡、火鸡13牛猪羊10海龟15狗驴11小麦35粗糙链孢霉43酵母菌44（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。肌红蛋白的结构与功能（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点（1963年，Kendrew）：a.一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。肌红蛋白的结构血红素（铁卟啉）辅基的结构及其氧合部位肌红蛋白的氧合曲线Y=[Mbo2][Mbo2]+[Mb](Y代表在给定的氧压下肌红蛋白的氧饱和度)Y=PO2K+PO2（1）（2）由（1）可见：Y=1时，表明所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白为氧饱和。由（2）可见：Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K解离常数为肌红蛋白一半被饱和时的氧压。Po2Y1.00.51020304050血红蛋白的结构、功能及镰刀形贫血病（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH。（2）血红蛋白的结构特点：a.四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000；b.成人的血红蛋白为22；c.链由141AA残基组成，链由146AA残基组成。四个肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。血红蛋白（Hemoglobin,Hb)Hb(Mr64500)几乎呈球形(d=5.5nm)，四聚体，血红蛋白的四级结构显示了不同亚基间强的相互作用。11界面(22)间存在强相互作用，即使用尿素处理，得到的是完整的二聚体，界面间是明显的疏水作用，但也存在许多氢键和一些离子对作用。结合氧后引起结构改变血红蛋白有两个主要的构象：R态(relaxed)和T态(tense)，氧可以与两种状态结合，但对R态的亲和力更大。无氧结合时，T态更稳定，表现出去氧血红蛋白的主要的构象。T态因更多的离子对作用更为稳定，其中的多数存在于12（及21)界面间。氧与Hb一个亚基的T态结合，引起构象改变为R态，当整个蛋白质发生这样的构象改变，单个亚基的结构几乎没有改变。但亚基对相互滑动和旋转，使得亚基间的口袋变窄。这一过程中，稳定T构象的一些离子对被打破，同时产生一些新的离子对。去氧血红蛋白的T状态►►TR转变。带正电荷的侧链（蓝色）和带负电荷的侧链（粉红色）形成离子对。每个亚基的LysC5和每个亚基的AspFG1能够看到，未作标记。与氧结合时血红蛋白的变构过程1.血红素中铁原子的变化高自旋状态低自旋（非氧合，原子半径较大）（氧合，原子半径较小）结合氧的血红素附近的构象变化。MaxPerutz假定TR的转变是由于血红素周围几个关键氨基酸侧链位置的改变所引起的。T态的血红素轻微皱褶，引起血红素铁突出His的侧链。氧的结合引起血红素呈现更平坦的构象，将His侧链改变而接触F螺旋。2.亚基三级结构及整个蛋白四级结构的变化铁原子的位移F8His的位移使F螺旋、EF拐角及FG拐角发生位移F螺旋向H螺旋移动氢键断裂导致四级结构的盐桥破坏挤出BPG分子。•脱氧血红蛋白与氧合血红蛋白构象的转变TR紧张态松弛态构象紧密构象松弛氧亲和力低氧亲和力高血红蛋白的变构•别构蛋白：蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。别构蛋白都有别构效应。•别构效应：蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。•别构蛋白一般都是寡聚蛋白质。O2HbHb-O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血红蛋白输氧功能和构象变化S形（协同）结合曲线。可以看成反映低亲和与高亲和状态转变的杂合曲线。表明血红蛋白在组织和肺之间对氧浓度微小差异更为敏感，使得血红蛋白在高氧分压的肺中能够结合氧，在低分压的组织释放出氧。pH对氧与血红蛋白结合的影响。肺中血液的pH为7.6，组织的血液pH为7.2，实验测定血红蛋白与氧的结合在pH7.4。H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响氧亲和力：指血红蛋白对于氧的结合牢固程度。（在一定氧分压下，氧亲和力越高，即氧结合越牢固。相反，氧亲和力越低，组织就能得到更多的氧供应）H+、CO2的影响：1914年，C.Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2——血红蛋白对O2、H+和CO2结合的这种相互关系叫波耳效应。HbO2+H++CO2HbH+CO2+O2肌肉pH7.2肺泡pH7.6波耳效应的生理意义BPG的影响：BPG和O2对血红蛋白的结合是排斥的BPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义：BPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的BPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。BPG浓度越大，O2的释放量越多。红细胞中BPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液。Po2Y1.00.5有BPG氧与血红蛋白的结合受2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的调控2,3-二磷酸甘油酸(BPG)与Hb的作用表现为一种向异性的变构调控行为。红细胞中BPG的浓度相对较高。BPG能大大降低Hb对氧的亲和力。HbBPG+O2HbO2+BPGBPG结合Hb的位点与氧的不同，可以调控肺中与氧分压相关的氧与Hb的亲和力。高纬度时，BPG对于较低氧分压的生理适应起着重要作用。健康人体在海面上能释放40%的氧进入组织，如果被迅速转移到4500米的山上(pO2低)，其向组织释放氧的能力降低。几个小时后血液BPG的浓度上升，降低Hb与氧的亲和力，这种调节对于肺中氧的结合影响不大，但对组织中氧的释放影响很大，可以恢复释放血液携带氧的40%进入组织。正常人位于海平面时血液中的BPG约为5mM，高纬度时约为8mM。BPG与去氧血红蛋白的结合。BPG的结合稳定去氧Hb的T态(a)，BPG所带负电荷与T态亚基口袋周围的正电荷侧链作用(b)，由于氧的结合，T态转变为R态，BPG结合的口袋消失(c)。煤气中毒的机制一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。血红蛋白分子病MolecularDiseaseofHemoglobin有时候蛋白质上的一个点突变会造成对蛋白质结构和功能的巨大影响镰刀状细胞贫血病（Sickle-CellAnemia）基因变异直接影响蛋白质特性，表现出不同遗传性状。例如人的镰形红血球贫血症。红血球碟形HbAHbS突变HbC红血球镰刀形血红蛋白分子有四条多肽链：•两条α链(141个氨基酸/条)；•两条β链(146个氨基酸/条)。HbA、Hbs、Hbc氨基酸组成的差异在于β链上第6位上氨基酸（亚基完全相同）：HbA第6位为谷氨酸（GAA、GAG)；HbS第6位为缬氨酸（GUA、GUG)；HbC第6位为赖氨酸（AAA、AAG）由于链一个氨基酸的突变（6Glu6Val），去氧血红蛋白S的表面换成了一个疏水侧链，进一步引起分子发生线性缔合，形成长链，多条长链进一步聚集成多股螺旋的不溶性纤维。HbS与HbA的四级结构差别不大，但在低氧（脱氧）时，HbS的溶解度急剧下降（为正常脱氧Hb的1/25）。产生贫血症的原因：单个碱基的突变引起氨基酸的改变导致蛋白质结构发生变化，直接产生性状变化。正常碟形红血球转变为镰刀形红血球缺氧时表现贫血症。HbAHbSHbC蛋白质结构与功能的关系及其研究方法1、研究方法2、免疫体系中分子间的识别机制3、DNA与蛋白质的相互作用4、蛋白水解酶与疾病5、膜蛋白、受体与信号转导6、酶抑制剂与药物开发7、新技术与新方法•X-Ray衍射•NMR(核磁共振)•MolecularModeling(Simulation)•Mutation/Function(分子生物学)•结晶困难•分子量不能太大•理论不太完善•费时费力免疫体系分子的识别机制HelperTcell--免疫体系的关键细胞辅助T细胞巨噬细胞：吞噬抗原-加工抗原-递呈给休止的辅助T细胞-辅助T细胞被活化-（1）激活免疫系统攻击已识别的抗原；（2）增生B细胞；（3）增生杀伤T细胞MHCIIKillerTCell--保卫我们的主要战士杀伤T细胞对抗入侵细胞的卫士，但必须激活，首先要识别和结合特定的抗原片段-递呈抗原-MHCI-激活的杀伤T细胞进攻带有识别抗原的病毒并消灭之。MHCI两种T细胞上的MHC分子是特异性识别的关键主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)早期从组织器官移植实验中发现