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蛋白质的理化性质、测定及分离纯化蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及应用•蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；•具有特定的空间构象，分子量一定分子筛层析；•在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；•一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。蛋白质的胶体性质•蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围--水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。•与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质--透析(dialysis)。------------++++++++++++------------•颗粒大小：在1-100nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。•稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷相同•不通透性：半透膜(semipermeablemembrane)蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。分散相质点小于1nm为真溶液，大于100nm为悬浊液，介于1-100nm为胶体溶液。透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。常用温度：4℃，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。MWCO:molecularweightcut-off疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。s=v/ω2rs是沉降系数(sedimentationcoefficient)，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，蛋白质、核酸、核糖体、病毒等的沉降系数通常为1-200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S（斯维德贝格单位，Svedbergunit），即1S=10-13秒，如血红蛋白的S约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。蛋白质的两性电离和等电点蛋白质由氨基酸组成，分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，如Glu、Asp残基中的γ和β-羧基，Lys残基中的ε-氨基，Arg残基的胍基和His的咪唑基。作为带电颗粒，可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷性质。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液pH影响。当处于某一pH时，蛋白质兼性离子(zwitterion)的净电荷为0，此时溶液的pH值为蛋白质的等电点(isoelectricpoint，pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。溶液中的蛋白质颗粒•pH=pI时，蛋白质分子所带净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动。•pH＞pI时，蛋白质分子所带净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动。•pH＜pI时，蛋白质分子所带净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动。在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用，所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。蛋白质在等电点时的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用蛋白质的变性(Denaturation)天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性，即蛋白质的变性作用(denaturation)。变性只是蛋白质空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两大类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。在变性因素的作用下，可导致各种变性现象。首先是生理活性丧失，如酶变性后，失去催化功能；激素变性后，失去生理调节功能；微生物体内的蛋白质变性后，微生物失去生命力而死亡。这是变性作用最主要的特征。此外，变性后的蛋白质还表现出各种物理和化学性质的改变。天然蛋白质变性后，多肽链松弛伸展，导致粘度增大，内部的侧链疏水基团暴露于表面，导致溶解度下降而易沉淀。同时由于变性后，结构松散，侧链基团暴露，还使得其易于发生化学反应，例变性蛋白质容易被酶水解。由于疏水侧链暴露，可能导致紫外吸收增加。变性与复性•变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性(renaturation)。如核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键，在β-巯基乙醇和8M尿素作用下，发生变性，失去生物学活性，变性后如经过透析去除尿素，β-巯基乙醇，并对空气缓慢氧化使疏基氧化成二硫键，酶蛋白又可恢复其原来的构象，酶学活性也几乎全部恢复，称为变性核糖核酸酶的复性。•许多蛋白质变性时被破坏严重，即使撤去变性因素也不能恢复，称为不可逆性变性。RNase的变性与复性盐析(SaltingOut)在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质胶体的稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。蛋白质的盐溶和盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度（硫酸铵浓度）盐析盐溶蛋白质的沉淀(Precipitation)•蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象-蛋白质沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。•蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至pI和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。但如将溶液pH调节到蛋白质pI，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。+++++++-------+-蛋白质胶体颗粒的沉淀（沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）重金属盐沉淀蛋白质•蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。•临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质•蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。•临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。有机溶剂沉淀蛋白质可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。不可逆沉淀•指沉淀出来的蛋白质分子，其内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失，沉淀也不重新溶解。•在蛋白质溶液中加入某些水溶性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等，由于这些溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质胶体外层的水化膜，并可逐步进入蛋白质的内部，有利于蛋白质的沉淀，此种作用在短时间及低温时，沉淀是可逆的，但作用时间长或温度较高时，则是不可逆沉淀。•三氯乙酸、苦味酸、磷钨酸、鞣酸等生物碱沉淀试剂，能与蛋白质阳离子结合生成不溶物,而使蛋白质发生不可逆沉淀。如：+H3N-Pr-COO-+Cl3C-COO-[H2N-Pr-COO-]O-CO-CCl3↓•Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金属阳离子，能与蛋白质阴离子结合生成不溶物，使蛋白质发生不可逆沉淀。例如：H2N-Pr-COO-+Ag+H2N-Pr-COOAg↓加热凝固(Coagulation)•将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。•蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。如蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带有大量电荷，仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱或强酸溶液的pH调节到pI，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。蛋白质的紫外吸收•波长：280nm•引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸(Trp）和酪氨酸（Tyr)的共轭双键，Phe在紫外光下也有光吸收。•可用于蛋白质的定量测定。波长范围：200-400nm蛋白质的颜色反应I1.双缩脲反应(biuretreaction)，蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。2.米伦反应(millonreaction)，蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应。3.茚三酮反应(ninhydrinreaction)，α－氨基酸与水合茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。4.黄蛋白反应，蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸（如Tyr、Phe等），当其与硝酸共热时，则呈黄色，再加碱则颜色变为橙黄。这一反应称为黄蛋白反应。一般蛋白质常含有Tyr和Phe残基，因此这一反应是蛋白质较为普遍的颜色反应。蛋白质的颜色反应II5.含硫蛋白质的反应，如果蛋白质分子中含有Cys或Met等含硫氨基酸残基，当与碱及醋酸铅共热时，分解产生的硫遇铅盐即产生黑色的硫化铅沉淀。6.色氨酸反应，将蛋白质溶液与几滴乙醛酸混合后，再沿器壁慢慢加入浓硫酸，如果蛋白质分子侧链中有吲哚环，则两液层的界面上会出现紫色环，这个反应称为色氨酸反应，又称为乙醛酸反应或霍普金（Hopking）反应。可用来检验蛋白质或肽的分子中是否有Trp残基。蛋白质的颜色反