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分子生物学MolecularBiology分子生物学•从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。研究核酸等生物大分子的形态结构特征、功能及其重要性和规律性科学，是人类从分子水平上揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。•分子生物学关心的是核酸在细胞生命过程中的作用，包括核酸本身的复制、保存以及基因的表达调控规律。•这门学科应该被称为核酸生物学（BiologyofNucleicAcid)。分子生物学狭义定义为以中心法则（Centraldogma）为主线的生物信息流及其机制.F.Crick’scentraldogmaDNA1957年转录RNA翻译ProteinDNA1970年反转录ProteinRNAReplicationReplicationReplication生理功能生理功能DNARNA蛋白质生理功能复制转录反转录tRNA和rRNA翻译小RNA(microRNAs)非编码RNA（non-codingRNAs)二十一世纪后修正的中心法则分子生物学的研究简史•分子生物学研究可能起源于德国。1869年，Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中提取了DNA。•1910年，Kossel第一次分离获得单核苷酸，揭开了研究核酸的序幕。•这140年的历史大致可以分为1940年以前的奠基阶段，通过孟德尔、摩尔根等的努力，认识了生命遗传的分子基础。•1940年后，在Griffith与Avery的遗传转化实验、Hershey和Chase证实了DNA是遗传物质的实验、Watson和Crick提出了DNA反向平行双螺旋的结构模型、Jacob和Monod（1965）阐明了原核基因表达调控的操纵子学说，分子生物学进入了飞跃发展时期。1968年，Nirenberg（美）由于破译DNA遗传密码的贡献，与Holly和Khorana分享诺奖。1975年，Temin、Dulbecco和Baltimore（美）发现RNA肿瘤病毒中存在以RNA为模板，反转录生成DNA的反转录酶。1980年，Sanger设计测定DNA序列方法与Gilbert和Berg分获诺奖化学奖。1983年，McClintock（美）发现可移动的遗传因子。1984年，Kohler（德）、Milstein（美）和Jerne（丹麦）发展了单克隆抗体技术。1989年，Altman和Cech（美）核酶的发现；Bishop和Varmus发现正常细胞同样带有原癌基因。1993年，Roberts和Sharp（美）发现断裂基因；Mullis发明PCR仪及Smith设计基因定点突变。1994年，Gilman和Rodbell发现G蛋白在信号传导中的作用。1995年，Lewis（美）、Nusslein-Volhard（德）、Wieschaus（美）果蝇体节发育基因。1996年，Doherty(澳大利亚）和Zinkernagel（瑞士）发现T淋巴细胞免疫机制。1997年，Prusiner（美）发现朊病毒（Prions)是阿尔茨海默病原。1999年，Blobel（美）阐述蛋白质在细胞间转运机制，明确信号肽及信号识别复合物。2001年，Hartwell（美）、Hunt和Nurse（英）细胞周期调控因子。2006年，Kornberg（美）揭示真核细胞转录机制。分子生物学的主要研究内容分子生物学的三条基本原理•构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；•生物体内一切有机大分子的构成都遵循共同的规则；•某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。研究内容•DNA重组技术–大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，提高产量，降低成本。–定向改造某些生物的基因组结构，使它们具备特殊经济价值或功能的提高。–基础研究。•基因表达调控研究•生物大分子的结构功能研究—结构分子生物学•基因组、功能基因组与生物信息学研究DNAReplication•半保留复制机制•复制起点和方向•Okazaki(冈崎)片段•复制的几种方式•DNA复制相关酶•大肠杆菌DNA合成全过程•真核生物DNA的复制半保留复制机制SemiconservativeReplicationMechanismofDNA半保留复制•半保留复制假说是Watson和Crick在1953年发表DNA双螺旋结构不久后提出的。•1957年，MatthewMesselson和FranklinStahl设计了令人折服的实验证明了DNA的半保留复制机制。•DNA的复制遵循半保留原则进行，亲代DNA分子每一条链各自作为模板，合成一条互补链，新合成的两条链中一条是旧链，一条为新链。半保留复制Messelson-StahlExperimentMesselson-StahlexperimentDNA聚合酶催化的DNA链的合成需要模板DNA、底物dNTPs、合成方向5’→3’复制的起点和方向OriginandDirectionofDNAReplication复制起始点•从细菌、酵母、线粒体和叶绿体中鉴定出的起始点的共同特点是含有丰富的AT序列，可能有利于DNA复制启动时双链的解开。•通常细菌、病毒、线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的。而真核生物基因组可以同时在多个复制起始点进行双向复制，基因组中包含多个复制子。•无论原核生物还是真核生物，DNA的复制是从固定起始点以双向等速的方式进行复制。DNA复制的起点和方向大肠杆菌和其他细菌DNA的复制有一个固定的起点，称为复制起点replicationorigin(ori),复制从ori的两个方向同时进行，形成两个复制叉(replicationfork)。oriC是大肠杆菌的复制起始点，由245个碱基组成.StructureoforiCEcoli基因组只有一个oriC,但人的基因组有上万个复制oriDNAreplicationofE.coli电镜照片新生链（红色）复制时，双链DNA解开成两股链分别进行，因此复制的起点呈现叉状形式，被称为复制叉(replicationfork)。DNA的复制是由固定的起点开始的。把生物体的复制单位称为复制子(replicon）。一个复制子只含有一个复制起点。物种细胞内复制子数目/个平均长度/kb复制子移动速度/(bp/min)大肠杆菌1420050000酵母500403600果蝇3500402600爪蟾15000200500蚕豆35000300？部分生物复制子的比较冈崎片段(Okazakifragment)双链DNA的两条链走向相反，而DNA的合成酶只能5’→3’的方向合成，这显然矛盾.冈崎(ReijiOkazaki)利用同位素标记新生DNA分子后发现，半数同位素先参入到较短的DNA片段中.ThreemodelsforDNAreplicationforkOkazaki证明为这种WhatOkazakidid？Pulse-labeling实验：大肠杆菌在含同位素培养基中培养30秒（红）后将分离大肠杆菌DNA，在碱性条件下超离心；Pulse-chase实验:将大肠杆菌在含同位素的培养基中培养30秒钟（红）后切换到正常培养基中进行培养，几分钟后分离DNA，在碱性条件下进行超离心。先导链滞后链（后随链）RingstructuremodelforthelaggingstrandofDNAreplicationDNA复制的几种模式双向复制(Bidirectional)形(大肠杆菌等细菌DNA)线性染色体(真核细胞)单向复制(Unidirectional)D型(病毒DNA)滚环式(噬菌体DNA)生物体DNA双链的复制大都是以半保留方式进行的，这是共性；但不同生物体内DNA的存在形式各不相同，有大、有小、有线性分子、有环状分子；功能状态也不一样，有的保守，有的则极为活跃。因此反映在复制方式上也有差别，这是个性。环状DNA双链的复制环状DNA双链的复制分为型、滚环型和D-环型几种类型。（1）型，大肠杆菌基因组的复制原点位于Asn合酶和ATP合酶操纵子之间，全长245bp，称为OriC。富含AT，并含有多个短的重复序列，能够被复制起始点结合蛋白所识别。复制的起始点涉及DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成RNA链，作为起始DNA复制的引物。（2）滚环型（rollingcircle），单向复制的一种特殊形式。滚环复制在噬菌体中是很常见的，如x174的双链环状DNA复制型（RF）就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5’端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3’-OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。PatternsofDNAreplicationa,b还可有单向和双向之分（3）D-环型（D-loop），单向复制的一种特殊形式，这种方式首先在动物线粒体的DNA复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，最初仅以一条母链作为新链合成的模板，迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。单个D-环结构在哺乳动物线粒体中是一段开放的500-600碱基序列。维持D-环结构的短链是不稳定的，它经常被解链和重新合成以维持该位点的双链开环结构。有些线粒体DNA拥有几个D-环结构，反映出细胞有多个起始点。叶绿体DNA也采用同样的机制。高等植物的叶绿体DNA有两个D-环结构。线性DNA双链的复制•复制叉生长方式有单一起点的单向（如腺病毒）及双向（如T7噬菌体）和多个起点的双向几种。由于DNA聚合酶和RNA聚合酶只能从5’端向3’端移动，因此DNA双向复制时，复制叉处呈“眼”型。•线性DNA在复制中，当RNA引物被切除后，留下5’端的部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，子链短于母链。因此线性DNA复制子末端的复制需要有以下特殊的机制：（1）将线性复制子转变为环状或多聚分子。T4和T7噬菌体就是这种机制。（2）在DNA末端形成发夹结构，使该分子没有游离的末端，草履虫的线性DNA就是一个典型的例子。（3）在某种蛋白质（如末端蛋白,terminalprotein）的介入下，在真正的末端上启动复制。29噬菌体DNA和腺病毒DNA的复制主要依赖这一机制。原核生物DNA复制的特点原核生物DNA复制的特点大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，复制起始后，在OriC上形成的两个复制叉沿着整个基因组双向等速进行移动，DNA复制的中间产物可形成一个，两个复制叉在距离起始点1800处回合。DNA双螺旋的解旋•DNA复制时，双链首先解开，形成复制叉。由多种蛋白质和酶参与。拓扑异构酶I解开负超螺旋，与解链酶共同作用，在复制起始点处解开双链，还有Dna蛋白参与，一旦局部解开双链，必须有SSB蛋白稳定解开的单链。•引发酶等组成的引发体迅速作用于两条单链DNA，前导链及后随链都需要一段RNA引物以起始子链DNA的合成。•重要的酶和蛋白质包括：InitiationofDNAreplication（1）DNA解链酶（DNAhelicase），通过水解ATP获得能量解开双链DNA。大多解链酶可沿后随模板链的5’→3’方向并随复制叉的前进而移动。只有Rep蛋白是沿前导链模板的3’→5’方向移动。（2）单链结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB蛋白），SSB可以在远低于解链温度时使双链分开并牢牢结合在单链DNA上，并表现出结合的协同效应（第一个结合能力假设为1，第二个结合能力高达1000）（真核生物中无协同效应）。（3）DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase），大多数天然状态下的DNA分子都有适度的负超螺旋，可以形成部分的单链结构，利于蛋白质与DNA的结合。复制过程中，随着DNA的解旋双螺旋的盘绕数减少，超螺旋数增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠绕更加紧密，形成的压力阻止解链的继续进行。拓扑异构酶能够消除解链造成的正超螺旋的堆积，消除阻碍解链继