复旦生物化学分子生物学部分课件-RNA代谢

RNAmetabolismCentraldogmabyF.CrickDNA1957TranscriptionRNATranslationProteinDNA1970ReversetranscriptionProteinRNA转录TranscriptionFromDNAtoRNA转录—以DNA为模板，按碱基配对原则（dA-U、dT-A、dG-C、dC-G)合成RNA链。1.都是酶促的核苷酸聚合过程；2.都需依赖DNA的聚合酶；3.模板均为DNA；4.延长机理都是形成磷酸二酯键；5.方向均为5′→3′;6.都遵从碱基配对规律—但转录忠实性要低于DNA复制;7.转录与复制都受到严格的调控。转录与复制的相似点复制转录模板DNA双链DNA的一条链原料dNTP(N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)引物需要不需要酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物DNARNA配对A-T、G-CA-U、T-A、G-C进程可一段一段复制中途不停止转录与复制的不同点RNA的合成称为转录(transcription)，是以DNA为模板由RNA聚合酶催化的反应,RNA的延伸方向为5’→3’.NTP＋(NMP)nRNA聚合酶(NMP)n+1+PPiRNA延伸了的RNA1961年S.Spiegelman用分子杂交方法证明了DNA与RNA之间的对应关系原料:NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）模板:DNA酶:RNA聚合酶（RNApolymerase,RNA-pol）其他蛋白质因子RNAtranscriptioninEcoli•Definitionoftemplatestrand•RNApolymeraseofEcoli•DNAsequenceofapromoter•BindingofRNApolymerasetoapromoter:experimentalevidence•Startoftranscription•TerminationoftranscriptionE.ColiRNA聚合酶是由五种亚基组成（2()，MW48000）。σ亚基加上核心酶(α2ββ´)称为全酶（holoenzyme)。亚基分子量功能36512决定哪些基因被转录150618催化功能155613结合DNA模板70263辨认起始点ω9000未知，酶制剂有，全酶中无RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合RNA聚合酶—Structure&functionofEcoliRNApolymerase启动子识别,有多种类型,延伸时脱落功能未知酶活性中心由这两个亚基形成与调控序列结合不同亚基可以辨别不同的启动子，具有调控不同基因转录起始的作用，以适应环境变化及生物生长发育不同阶段的需求。利福霉素结合到β亚基导致酶失活，放线菌素D插入到双链DNA而阻止RNA聚合酶的移动精确性104-105其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。原核生物的RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的亚基特异结合，从而影响酶的活性。大肠杆菌中的RNA聚合酶转录RNATemplatestrandvsnontemplatestrand在病毒中两条链可以同时成为模板链，但密码不同的蛋白质双链DNA分子中能作为模板转录出RNA的那条链，称为模板链。又叫有意义链（sensestrand）或Watson链。另一条互补链称为编码链，又叫反义链（antisensestrand）或Crick链。与转录起始有关的DNA结构启动子(Promoter)•RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子。•－10区，保守序列为TATAAT--Pribnow框（pribnowbox,TATA框），是RNA聚合酶的牢固结合位点，简称结合位点。•σ的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。细菌中常见两种启动子突变：-启动子上升突变，提高转录活性；-启动子下降突变，降低转录水平。由含70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子PribnowboxPribnowbox•Sextama框：－35区，保守序列为TTGACA--Sextama框，是RNA聚合酶中σ的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。•Pribnow框与Sextama框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；•天然启动子这段距离多为15～20bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。•实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。足迹法原理(Footprinting)利用足迹法确定RNA聚合酶结合位点的实验大肠杆菌RNA聚合酶的转录起始RNA起始核苷酸为pppG或pppA终止子结构•提供转录终止信号的序列--终止子（terminator），终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。•原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于ρ因子的转录终止；一类是依赖ρ因子的转录终止；•两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。•两类终止子碱基组成的不同点：不依赖ρ因子回文结构富含G-C下游富含A-T依赖ρ因子G-C含量较少下游无特征终止子(terminator)结构依赖Rho因子的转录终止ρ因子非依赖型转录终止原核生物转录的起始•转录起始需解决两个问题：•RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。•DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。转录起始过程1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）2.RNA聚合酶全酶(2)与模板－35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。3.RNA聚合酶向－10区转移，并与之牢固结合。4.－10区DNA双链解开12～17bp，形成开放的二元启动子复合物（模板－酶）。5.在RNA聚合酶β亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板－酶－RNA）。5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppiRNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点、一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。6.当三元复合物中RNA长6～9个核苷酸时，因子从全酶解离下来，进入延长阶段。原核生物转录的延长1.亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下NTP不断聚合，RNA链不断延长。3.碱基配对原则：A-U，T-A，G-C4.延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。5.原核生物的转录和翻译偶联进行。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi转录空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）····DNA····RNA原核生物转录的终止和新生RNA链的释放RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类•依赖ρ因子的转录终止•非依赖ρ因子的转录终止RNAtranscriptionineukaryoticcells•ThreetypesofRNApolymerases•PromoterofRNApolymeraseII•MultipleproteinsinvolvedinRNAtranscriptionbyRNApolymeraseII•StartoftranscriptionbypolymeraseII•Promoterof5SrRNAgeneislocatedinsidethegene•post-transcriptionalRNAprocessing真核细胞三种RNA聚合酶的分工不同•RNApolymeraseI：转录rRNA前体•RNApolymeraseII：转录mRNA•RNApolymeraseIII：转录tRNA,5SrRNA蝇蕈素核仁核质SmallnuclearRNA真核细胞的三种RNA聚合酶酶位置产物活性比较对α-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核浆hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核浆小RNA10%有种属特异性真核细胞的三种RNA聚合酶放线菌素D和吖啶的抑制机制Amanitin作用在II和III型RNA聚合酶上只抑制原核生物某些常用的转录抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与β亚基结合，阻止起始链霉溶菌素细菌的核心酶与β亚基结合，阻止延长放线菌素D真核RNA聚合酶Ⅰ与DNA结合，并阻止延长α-鹅膏蕈碱真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅱ结合一些常用的转录抑制剂真核生物的启动子真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。RNA聚合酶Ⅰ的启动子即rRNA基因的启动子，称Ⅰ类启动子。Ⅰ类启动子分两部分：-40～+5称为近启动子，决定转录起始的位点；-165～-40称为远启动子，影响转录的频率。RNA聚合酶Ⅱ的启动子即mRNA基因的启动子，称Ⅱ类启动子1、帽子位点（capsite）：即转录起始位点，其碱基大多为A。2、TATA框：又称Hogness框，由含有TATA的6～7个核苷酸组成，保守序列为TATA（A/T）A（A/T）。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。TATA框位于－25--30附近，是解链位置，决定转录起始位点。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。3、CAAT框：与RNA聚合酶的结合有关位于－75附近，保守序列为GGNCAATCT。头两个G非常重要，一但突变，转录效率大大下降。CAAT框控制着转录起始的频率。4、GC框：某些转录因子可结合位于－110附近，以5′CCGCC3′序列为特征。CAAT和GC框为上游因子，对转录起始频率有较大影响。5、增强子（enhancer）及作用特点：能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。⑴增强效应明显：使转录频率增加百倍或千倍。⑵增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以5´→3´或3´→5´排列对启动子都有作用。⑶多为重复序列：约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。⑷增强效应具有严密的组织和细胞特异性。⑸没有基因专一性。⑹许多增强子受外部信号的调控。RNA聚合酶II的启动子序列特征•转录起始位点没有广泛的序列同源性，但第一个碱基为腺嘌呤，而两侧是嘧啶碱基。这个区域被称为起始子（initiator，Inr），序列可表示为Py2CAPy5。Inr元件位于-3—+5。仅由Inr元件组成的启动子是具有可被RNA聚合酶II识别的最简单启动子形式。•多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定。•也有一些II类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。RNA聚合酶II启动子上发生的事件RNA聚合酶Ⅲ的启动子即tRNA基因的启动子，称Ⅲ类启动子。Ⅲ类启动子位于转录起始点下游，称下游启动子或内部启动子。Ⅲ类启动子包括：A盒、B盒。A盒靠近5′方向；B盒靠近3′方向。Ⅲ类启动子需要的转录因子包括：TFⅢC、TFⅢB、TFⅢA，前两者是共同的，后者为5SrRNA基因转录所需。RNA聚合酶III识别的启动子在基因内爪蟾5SrRNA基因启动子的定位实验分析原核生物真核生物帽子结构没有有起始核苷酸嘌呤或嘧啶嘌呤（A为主）启动区范围较小(＋1～－70)较大(＋1～－110)上游序列TTGACACAAT、GC、增强子真核生物和原核生物转录起始位点的结构差异原核生物与真核生物启动子比较真核生物转录的起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。TATAbox：启动子核心序列，-25bp区段。CAAT盒GC盒增强子顺式作用元