复旦生物化学分子生物学部分课件-重组DNA

RecombinantDNA•基础知识•克隆载体及基因克隆•cDNA文库/GenomicDNA文库•表达载体•重组DNA技术的应用Termsincommonuse•DNA/Genecloning基因克隆•Vector载体(一般为质粒DNA)•Geneengineering基因工程•Genemanipulation基因操纵•RecombinantDNA重组DNA•Transgene/Transgenicanimal(plant)转基因/转基因动(植)物•cDNA/GenomicDNAlibrarycDNA/基因组(总)DNA文库基本概念•克隆（clone）&克隆化（cloning）•DNA克隆（DNAcloning）分子克隆（molecularcloning）重组DNA（recombinantDNA）•工具酶（toolenzymes）restrictionenzymes（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）•目的基因（targetgene)•基因载体（vectors）DNA克隆（基因克隆或重组DNA）应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA连接成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通过体外重组技术，将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。•1973Cohen第一例成功的克隆实验。•1978重组人胰岛素（rhinsulin）(第一个基因工程蛋白药物--Genentech公司)。•1982重组人胰岛素在英、美获准使用。•1985第一批转基因家畜(兔、猪和羊),中国转基因鱼。•1993基因工程西红柿在美国上市。•1997多莉羊诞生--英国罗斯林研究所。•1999.9中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%。•2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图。•2001.2.11公布人类基因组基本信息。•生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程。抑制和调节多种激素的作用人体生长激素释放激素(SS)从动物脑中提取:5mg---50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液基因克隆的技术路线目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）受体细胞转化筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA目的基因基因载体重组体切接转筛分表总体技术路线1973年StanleyCohen完成第一个基因重组实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：工具酶（限制性内切酶、连接酶等）基因载体受体细胞工具酶：基因工程中主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。•限制性核酸内切酶•DNA聚合酶I•逆转录酶•T4DNA连接酶•碱性磷酸酯酶•末端转移酶•TaqDNA聚合酶常用的工具酶限制性核酸内切酶特异碱基序列切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease,RE)一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该位点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性，一般分为三类：—Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。限制性内切酶主要是从原核生物中提取，通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。比如限制酶HincⅡ和HindⅢ则是分別來自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的c和d血清型菌株。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。•II型限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)：特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+⑴产生5'-粘性末端(stickyend,cohensiveend)-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-3'5'-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-+PstI3'5'⑵产生3'-粘性末端-G-CTTAA5'3'AATTC-G-3'5'-G-CTTAA5'3'AATTC-G-3'5'+EcoRI⑶产生平(头末)端/钝端(Bluntend,flatend,plainend,flushend)5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'+SmaI5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构一些常用的II型限制性内切酶DimericstructureoftypeIIrestrictionendonucleases粘性末端，也叫cohesiveend平滑末端在克隆载体中导入更多的酶切位点最常用的DNA聚合酶有以下4种DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶ⅠE.coliDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。DNApolⅠ的应用E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移Klenow酶（片段）（DNApol.大片断）聚合酶KlenowDNA[-32P]dNTPα双链DNA粘端5'-外切酶Ⅲ变性+5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'5'5'3'3'标记探针标记末端Klenow酶（片段）的用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；⑶在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷DNA序列分析。TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围：7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。逆转录酶特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子DNA连接酶(DNAligase)T4DNA连接酶碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。碱性磷酸（酯）酶基因载体（克隆载体）为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA。克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成肽链而设计的载体。质粒（Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞，具有:自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。该名词由J.莱德伯格在1952年提出，现在习惯上已用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的单纯的DNA分子。某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。pBR322质粒①4361bp②含一个复制起始点③含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)④一个抗四环素标记(tetR)⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入。当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).1977年构建成功的pBR322pBR322由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶pUC系列质粒pUC18/19衍生出：pBlueScriptIIpUC118/119,pTZ,pGEM,etc多克隆位点可进行兰/白筛选pBluescriptIIphagemidVector病毒质粒（Virion）即病毒颗粒，作为完整的病毒颗粒，只要具备形态学的条件，不论其有无感染性等生物活性，都是病毒颗粒。质粒是指病毒完全成熟阶段的颗粒型，它分为裸露的核衣壳质粒和被有包膜的核衣壳质粒。自R.W.Horne和S.Brenner于1958年首次用负染（negativestaining）法以来，用电子显微镜所进行的病毒颗粒超显微结构的研究飞速地发展着，因此，对病毒颗粒超显微结构的各部分的统一命名是必要的。1962年在ColdSpringHarborSym-posiumonQuantitativeBiology座谈会上，D.L.D.Caspar、A.Klug等7位著名的病毒学家提出的质粒、衣壳、亚基、核衣壳、包膜等新词及其定义，实际上已被公认。组成特点双链线状DNA分子，全长50kb，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS（cohensive-endsite）位点。λ噬菌体λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（Lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(Lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。λ噬菌体作为克隆载体填充DNABAC载体BacterialArtificialChromosomes1992年，shizuya等构建出BAC。YeastArtificialChromosomes1987年问世，容量几百-几千kb。可以通过同源重组的方式在酵母菌中对携带有基因组插人大片段的YAC进行操作，这些操作包括高效地引入报告基因、特定的缺失突变等，鉴于YAC转基因技术不仅保证巨大基因的完整性，保证所有顺式因子的完整并与结