搜索
微生物学第七章微生物的遗传变异和育种（2）复旦大学2018-11-271第三节基因重组和杂交育种本节重点：三种基因水平转移方式及其应用2基因的水平转移：个体A个体B遗传物质通过基因的重组可使后者（个体B）及其后代的性状发生改变。细菌所特有的基因重组形式，有别于一般有性过程中的亲本和其后代之间遗传信息的垂直传递形式。3水平基因转移（Horizontalgenetransfer,HGT），不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且也发生在微生物与高等动植物之间。生物间基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的重要动力之一。4细菌水平基因转移和重组：基因工程生物的生态安全病原菌的抗药性基因工程技术5细菌的三种水平基因转移形式接合（Conjugation）转导（Transduction）转化（Transformation）第三节基因重组和杂交育种6一、细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程：接合作用（conjugation）1.实验证据1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm大肠杆菌的多重营养缺陷型杂交实验7中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为何采用多重营养缺陷型菌株？尽可能地排除回复突变对实验结果的干扰！810接合的机制？证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验：质粒的主要类型质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子(Fertilityfactor，F因子)抗性因子(Resistancefactor，R因子)产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒(virulenceplasmid)代谢质粒(Metabolicplasmid)隐秘质粒(crypticplasmid)11细菌细胞壁以外的构造———性毛(pili,单数pilus)构造和成分与菌毛相同，但比菌毛长，数量仅一至少数几根。性毛一般见于革兰氏阴性细菌的“雄性”菌株（即供体菌）中，其功能是沟通、收缩使细胞靠近，实现F因子转移。有的性毛还是RNA噬菌体的特异性吸附受体。122.大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导；F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因13Tn，IS是转座因子，也是整合发生位点是多位点整合，方向不定F因子为附加体质粒,既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上14F因子的四种细胞形式a）F-：b）F+；（F因子独立存在，有性菌毛）；c）Hfr；F因子插入到染色体DNA上，有性菌毛。d）F′；F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子。细胞表面同样有性菌毛。（“雌性”菌株，无性菌毛）“雄性”菌株151）F+×F-杂交F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。16理化因子可消除F因子杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株（Hfr）2）Hfr×F-杂交17染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。18Hfr菌株与Ｆ＋：都有性菌毛，与F-细胞进行接合。区别是：Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F—。3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生同源重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；19F′因子传递基因，也叫性导，或Ｆ因子转导20Lederbergcoinedthetermplasmidinthe1950stodescribesuchapparentlyextrachromosomalgeneticelements,althoughitdidnotfindwideusageuntilthe1970swheninfectiousdrugresistancebecomeamedicalproblem,andgeneticengineeringbecomepopular.21图8-18细菌染色体从Hfr细胞向F-细胞转移(p227)研究发现，性毛并非接合转移的必要条件，该基因水平转移方式在微生物间广泛存在。2、抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)夫西地酸（fusidicacid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。接合转移是重要途径Science310,1456(2005)REVIEWTheInsandOutsofDNATransferinBacteriaIneˆsChen,1PeterJ.Christie,2*DavidDubnau1*1PublicHealthResearchInstitute,225WarrenStreet,Newark,NJ07103,USA.2DepartmentofMicrobiologyandMolecularGenetics,UniversityofTexasMedicalSchoolatHouston,Houston,TX77030,USA.细菌的三种水平基因转移形式接合转导转化√第三节基因重组和杂交育种26二、细菌的转导(transduction)由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体：转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导271、普遍性转导（generalizedtransduction）噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程(1)意外的发现1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用phe－trp－tyr－×met－his－结果获得了10－5的原养型重组子（phe＋trp＋tyr＋met＋his＋）。但将两个亲本放在U形管的两臂中，结果也能同样获得重组子，此和E.coli杂交是不同的28沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的（发现了普遍性转导------这一重要的基因转移途径）WhyandHow?29(2)转导模型30转导噬菌体为什么“错”将宿主的DNA包裹进去?噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。因为染色体上的pac与P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8。在50年代，沙门氏菌的遗传学研究系统尚未完善，所以转导的发现未能得到发展。1955年Lennox,E.发现了P1噬菌体可在E.coli中转导遗传物质，从而极大地促进了对普遍性转导的研究和应用。31P22DNA进入细胞，环化，滚环复制形成一个多联体；从特殊位点pac开始包装。形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：32普遍转导子的特点？普遍性转导的三种后果：１）进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子２）流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落33３）外源DNA被降解，转导失败。2、局限性转导（specializedtransduction）温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因（如半乳糖苷酶基因）转移到受体菌中342、局限性转导（specializedtransduction）局限性转导又称特异性转导（restrictedtransduction），也是由JoshuaLederberg及其学生所发现。λ噬菌体是否像P22进行普遍性转导？紫外线诱导野生型E.coliK12(λ)gal＋中的原噬菌体，使细胞裂解，收集裂解液去感染非溶源状态的gal—菌株，结果在基本培养基上选择到10－6gal＋的转导子。①部分转导子具有溶源性细菌所具备的“免疫力”，说明有功能的噬菌体存在于受体细胞中。②上述gal＋转导子细胞不能被诱导产生成熟的噬菌体颗粒（缺陷）。③gal＋转导子遗传特点不稳定，有1~10％又变成gal－，表明它又失去了gal＋，因此推论有些gal＋是随λ插入到受体的染色体中，形成部分二倍体，而不是通过双交换而产生的。新的现象：35举例：λ噬菌体的的溶源性反应：进入宿主后线状基因组依靠粘性末端环化36λ噬菌体的的溶源性反应：通过特定位点整合（切离）细菌染色体372、局限性转导（specializedtransduction）温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）形成的杂合DNA能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但感染受体细胞后没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，需通过同源重组进宿主染色体而形成稳定的转导子。（根据基因“丢失”的情况，有些缺陷的λ噬菌体仍可能整合进染色体，但不再是有完整功能的原噬菌体：形成不稳定的部分二倍体，宿主也获得免疫性。）3839①部分转导子具有溶源性细菌所具备的“免疫力”，说明有功能的噬菌体存在于受体细胞中。②上述gal＋转导子细胞不能被诱导产生成熟的噬菌体颗粒。③gal＋转导子遗传特点不稳定，有1~10％又变成gal－，表明它又失去了gal＋，因此推论有些gal＋是随λ插入到受体的染色体中，形成部分二倍体，而不是通过双交换而产生的。新的现象：λ噬菌体的的溶源性反应：基因组的表达与复制存在着强烈的时序性40λ噬菌体的溶源性反应：早期基因表达，产生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶对gpcII的降解。gpcII的积累促使阻遏蛋白cI的表达阻遏蛋白cI的积累导致噬菌体基因转录的终止，形成原噬菌体。早期表达的gpcro与cI的竞争最终确定λ噬菌体是进入溶源状态，还是进入裂解循环。（gpcro表达得早，但与基因组的结合能力较cI弱）阻遏蛋白cI同样可以抑制其它新侵入的λ噬菌体的表达，从而使溶源性细菌具有“免疫性”阻遏蛋白cI在一般情况下通过自身的转录激活保持低水平的表达，但有时种种原因转录水平下降，会偶尔导致溶源性噬菌体进入裂解循环（10-5~10-2）。41λ噬菌体的溶源性反应：外界因素如紫外线可引起宿主的染色体的破坏，宿主产生应激反应，合成具有DNA重组活性的RecA蛋白，具有酶活性，导致cI的被降解，噬菌体进入裂解循环。诱发裂解是检查是否存在溶源性细菌的有效方法42局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）局转,被转导