复旦微生物学实验课件6 API 20E鉴定肠杆菌科细菌和真菌个体形态观察

实验6API20E鉴定肠杆菌科细菌和真菌个体形态观察小杯小管脱水培养基等培养盒API20E系统：一种常用的鉴定肠杆菌科和其他部分革兰氏阴性杆菌的微量快速鉴定系统，包括鉴定卡和编码本（或数据库软件）。鉴定卡有20个反应室，反应室由小管和小杯组成，小管底部有脱水培养基和其他试剂。在反应室内加入菌悬液，然后把鉴定卡放入在培养盒中培养24h，根据21（20+OX）反应结果查阅编码本，得到鉴定结果。1，水解ONPG，产物黄色。2，水解产生碱性物质，指示剂变红色/橙色。3、4，产生碱性物质，指示剂变橙色/红色。5，利用柠檬酸根离子作为碳源，使之分解后溶液变碱，指示剂变色。6，产生的硫化氢和铅盐沉淀。7，尿素水解，产氨气，指示剂变红/橙。8，色氨酸脱氨，和FeCl3反应。9，色氨酸脱氨产成吲哚，加入吲哚试剂，生成玫瑰吲哚。名称反应/酶阴性阳性1ONPGβ-半乳糖苷酶无色黄色2ADH精氨酸双水解酶黄色红/橙色3LDC赖氨酸脱羧酶黄色橙色4ODC鸟氨酸脱羧酶黄色红/橙色5CIT柠檬酸利用淡绿色/黄色蓝绿/蓝6H2S产生无色/微灰黑色沉淀/细线7URE尿素分解酶黄色红橙色8TDA色氨酸脱氨酶黄色红紫9IND吲哚产生淡黄绿红10，如果生成3-羟基2-丁酮（甲基乙酰甲醇）或2，3-丁二醇，在碱性溶液中被氧化为二乙酰，二乙酰再和游离胍基（肌酸）反应，生成红色化合物。11，明胶被水解，其中包裹的黑色素扩散。12-20，利用各种碳源产酸，指示剂蓝变黄。21，氧化酶试验（OX），单独进行。无色TMPD试剂——紫色氧化TMPD（2甲基-对-笨撑二胺）名称反应/酶阴性阳性10VP甲基乙酰甲醇产生无色或粉色红11GEL明胶水解黑色素不扩散黑色素扩散12GLU葡萄糖产酸蓝/蓝绿黄色13MAN甘露醇产酸蓝/蓝绿黄色14INO肌醇产酸蓝/蓝绿黄色15SOR山梨糖产酸蓝/蓝绿黄色16RHA鼠李糖产酸蓝/蓝绿黄色17SAC蔗糖产酸蓝/蓝绿黄色18MEL蜜二糖产酸蓝/蓝绿黄色19AMY苦杏仁苷产酸蓝/蓝绿黄色20ARA阿拉伯糖产酸蓝/蓝绿黄色FD1009接种斜面，37℃培养20~24h步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸，用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）倾斜鉴定卡，在每个小管中各加入125μL菌悬液（注意避免气泡）步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）倾斜鉴定卡，在每个小管中各加入125μL菌悬液（注意避免气泡）培养盒加5mL保湿剂后，把鉴定卡平放入培养盒中步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）倾斜鉴定卡，在每个小管中各加入125μL菌悬液（注意避免气泡）培养盒加5mL保湿剂后，把鉴定卡平放入培养盒中反应名称标记方框，小杯加满把菌液步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）倾斜鉴定卡，在每个小管中各加入125μL菌悬液（注意避免气泡）培养盒加5mL保湿剂后，把鉴定卡平放入培养盒中反应名称标记方框，小杯加满把菌液反应名称标记横线，小杯中加满石蜡油步骤FD1009接种斜面，37℃培养20~24h湿润滤纸涂用白金接种环取菌，涂抹，加OX试剂，1~2min内变紫色为阳性用0.85%NaCl溶液制备菌悬液（1.5×108个/mL)（根据麦氏比浊管估计）倾斜鉴定卡，在每个小管中各加入125μL菌悬液（注意避免气泡）培养盒加5mL保湿剂后，把鉴定卡平放入培养盒中反应名称标记方框，小杯加满把菌液反应名称标记横线，小杯中加满石蜡油盖上培养盒上盖，并做好标记，37℃培养步骤鉴定卡加入试剂（TDA加TDA试剂，IND加JAMES试剂，VP加VP1和VP2试剂，各一滴）加入试剂步骤鉴定卡加入试剂（TDA加TDA试剂，IND加JAMES试剂，VP加VP1和VP2试剂，各一滴）根据说明书和/或比色卡，确定20个反应的结果（+/-）加入试剂+-+|---|--+|--+|+-+|+-+|-+-OX氧化酶步骤鉴定卡加入试剂（TDA加TDA试剂，IND加JAMES试剂，VP加VP1和VP2试剂，各一滴）根据说明书和/或比色卡，确定20个反应的结果（+/-）编码（20个反应加氧化酶实验，三个一组，得到7位数编码）加入试剂+-+|---|--+|--+|+-+|+-+|-+-OX步骤鉴定卡加入试剂（TDA加TDA试剂，IND加JAMES试剂，VP加VP1和VP2试剂，各一滴）根据说明书和/或比色卡，确定20个反应的结果（+/-）编码（20个反应加氧化酶实验，三个一组，得到7位数编码）7位数编码，查阅编码本，确定菌种名称加入试剂+-+|---|--+|--+|+-+|+-+|-+-OX步骤API20E细菌鉴定系统结果比对卡1ONPG无色黄色2ADH黄色红色,橙色3LDC黄色橙色4ODC黄色红色,橙色5CIT淡绿色/黄色蓝绿/蓝6H2S无色/微灰黑色沉淀/细线7URE黄色红橙色8TDA黄色红紫9IND淡黄绿红10VP无色或粉色红11GEL黑色素不扩散黑色素扩散12~20ARA蓝/蓝绿黄色步骤未知菌FD1009的编码结果分隔室号1234567891011试验项目ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGEL所定数值12412412412试验结果+-+-----+--记下数值10400000400编码504检索结果分隔室号12131415161718192021试验项目GLUMANINOSORRHASACMELAMYARAOX所定数值4124124124试验结果++-++-+-+-记下数值4104104020编码4552检索结果结果编码评价（法语）评价（英语）评价（德语）编码学名鉴定百分数T值%ID，该编号的菌株中该学名的百分比。T值，该编号生化反应总出现频率除以最典型菌的生化反应总出现频率。结论：经API20E系统鉴定，FD1009的编码为5044552，学名Escherichiacoli(大肠埃希氏菌)，鉴定百分数为99.8%，T值为0.94，是非常好的鉴定。19AMY产酸不同注意事项1.API20E是一种基于生理生化反应和数值分类原理的快速鉴定方法，结果仅供参考。2.API20E系统鉴定仅限于鉴定肠杆菌科和部分革兰氏阴性杆菌的纯培养。3.接种时，注意避免小管中产生气泡。如产生，需要倾斜鉴定卡，轻敲小室，排除气泡。4.培养24h后，观察结果。其中TDA反应、IND反应加入TDA试剂和James试剂后观察结果，VP反应加入VP1、VP2试剂10min后观察结果。5.如果编码对应几种细菌，需要用其他实验进一步区分，如编码本推荐的实验。6.即使肠杆菌科细菌，得到的编码在数据库中也可能不存在。三边出芽两端出芽多边出芽原理酵母菌：个体形态以单细胞为主的真菌，球形、椭圆形、卵圆状或棒状等，直径约5μm，主要繁殖方式是芽殖，个别裂殖，部分种产生假菌丝或荚膜。出芽方式：出芽酿酒酵母的多边出芽假菌丝：酵母菌芽殖后形成的子细胞与母细胞不分离，以狭小面积相连，形成的藕节状细胞链。原理克鲁维假丝酵母假菌丝的观察制片：取一环水，加在洁净载玻片中央。无菌操作取少量菌，在水滴中涂布数次，至水滴稍呈浑浊。小心盖上盖玻片，避免气泡。镜检：玻片标本置于显微镜下观察。先用10×物镜，再用40×物镜，观察克鲁维毕赤酵母的个体形态、出芽情况和假菌丝特征，拍照记录实验结果。步骤和方法原理特化的营养菌丝菌丝体的分化特化的气生菌丝假根吸收养料匍匐菌丝延伸附着枝附着菌核休眠菌环捕食无性有性分生孢子头分生孢子座孢子囊担子子囊壳接合孢子囊霉菌：菌丝体比较发达、不产生大型子实体的真菌。菌丝直径3～10µm，无隔或有隔。菌丝分营养菌丝和气生菌丝两部分。原理根霉的个体形态示意图根霉属（Rhozipus）菌丝无隔，弧形的匍匐菌丝生出假根，假根的对上方生出孢子囊梗，顶端生出孢子囊。内具囊轴，孢子囊成熟后，囊壁消解或成块破裂，释放孢囊孢子。原理根霉的个体形态示意图根霉属（Rhozipus）菌丝无隔，弧形的匍匐菌丝生出假根，假根的对上方生出孢子囊梗，顶端生出孢子囊。内具囊轴，孢子囊成熟后，囊壁消解或成块破裂，释放孢囊孢子。原理根霉的个体形态示意图根霉属（Rhozipus）菌丝无隔，弧形的匍匐菌丝生出假根，假根的对上方生出孢子囊梗，顶端生出孢子囊。内具囊轴，孢子囊成熟后，囊壁消解或成块破裂，释放孢囊孢子。原理菌丝有隔，菌丝上生出的分生孢子梗具横隔，末端生有帚状枝。帚状枝是由单轮、两轮或多轮分枝系统构成，对称或不对称，最后一级分枝称为小梗，产生分生孢子链。小梗着生于梗基上，梗基着生于副枝。小梗产生分生孢子链。少数种产生闭囊壳。展开青霉青霉属（Penicillium）原理曲霉属（Aspergillus）菌丝有隔，厚璧和膨大的足细胞垂直长出分生孢子梗。梗的顶端膨大形成顶囊，顶囊上生出一层或双层小梗。从小梗的顶端生出分生孢子链。顶囊、小梗和分生孢子链构成分生孢子头。曲霉属少数种形成闭囊壳。焦曲霉足细胞分生孢子顶囊分子孢子梗次生小梗初生小梗步骤1．制片在洁净载玻片上加1滴乳酸苯酚液，用无菌的解剖针（前端砸扁）从平板上挑取青霉/曲霉的生长物浸入乳酸苯酚液内，再用两根无菌解剖针将生长物撕开，使其全部打湿，盖上盖玻片。2．镜检①顶青霉的帚状枝、分生孢子梗、梗基和小梗形状。②黑曲霉的足细胞、分生孢子梗、顶囊和小梗形状。3．消毒和清洗将所有培养物在沸水中煮沸20min消毒，清洗。注意事项1.如果盖上盖玻片后有气泡，可以在火上略加热，除去气泡。2.曲霉的孢子头较大，不易看清小梗的结构，需要多观察几张玻片标本。3.操作霉菌应戴口罩，避免吸入较多的霉菌孢子。原理接合孢子和接合孢子囊异性的菌株接种在一块平板上，培养，异性菌丝伸出极短的侧枝，侧枝接触，膨大成两个原配子囊，并进一步发育成配子囊，经质配和核配，形成幼接合孢子囊，最终形成含一个接合孢子的膨大的接合孢子囊。蓝色犁头霉菌落淡蓝色或蓝紫色，孢子囊和孢囊孢子，具有假根和匍匐菌丝，假根和孢囊梗不对生，成熟的接合孢子囊黑色，被长的侧枝上生出的手指状附属物包围。根霉接合孢子囊形成示意图+-1．倒平板倒PDA平板，每皿加培养基约12mL，平置凝固彻底。2．划线接种在皿底用记号笔画2条线，八字形，如下图，用接种环分别划线接种“+”和“-”菌株，25~28℃培养5~7天。3．观察异性菌株间出现黑色接合孢子囊带。制片观察：载玻片上加乳酸苯酚液，用解剖针取少量接合孢子囊带部分的菌丝体，撕开后，盖上盖玻片，观察。直接观察：接合孢子囊带上压一片载玻片，用低倍镜和高倍镜观察不同阶段的接合孢子囊。步骤+-结果1．观察接合孢子囊带的特征；2．接合孢子囊形成过程中各阶段的特征。3．观察孢子囊和孢囊孢子。结合孢子囊、孢子囊和孢囊孢子囊接合孢子囊附属物侧枝孢囊孢子孢子囊内容•三点接种观察•API20E•酵母菌个体形态观察•青霉帚状枝和曲霉孢子头观察•蓝色犁头霉接合孢子囊观察20小时观察API结果（第二天中午12点）