复旦微生物学实验课件7 酒酿发酵中关键微生物的分离和鉴定

实验7酒酿发酵中关键微生物的分离和鉴定复旦大学生物科学国家级实验教学示范中心主讲教师：王英明•时间：两周，包括部分课外时间。•目的：（1）酒酿制作的原理和过程；（2）分离鉴定霉菌和酵母菌；（3）了解中国的传统文化和科技。酒酿糯米饭经小麯发酵得到的高糖低酒精的传统食品，即醪糟。醪，醪液；糟，沉滓。酉：酿酒容器加酒篓，酒。后酉指时间，酿酒（酉月，农历8月）和喝酒（酉时，17点~19点）。浊酒（白酒）：“浊酒一杯家万里‘，”白酒新熟山中归“绿酒（清酒）：“绿蚁新醅酒”，“金樽清酒斗十千”茅：包茅缩酒爵：酒器；爵位：就是爵放的位置。尊：大型盛酒器具。献酢酬：给客人倒酒，客人回敬，主人致谢（酬谢，酬劳）。祭酒：主持（用酒）祭祀的人，德高望重。原理，裂土分茅。酒精的生物合成葡萄糖丙酮酸酒精+CO2CO2糖酵解有氧/高糖/少量发酵（葡萄糖效应）有氧/三羧酸循环酒精+CO2无氧/发酵原理起源传说：仪狄/杜康，谷物酒。真实起源：推测是水果酒，天然酵母菌群，主要是酿酒酵母，利用水果中的可发酵糖（葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等）生成酒精。如酿造葡萄酒。类似的，甘蔗，糖蜜，朗姆酒。龙舌兰，果糖，龙舌兰酒。葡萄酒的酿制原理无氧原理酵母葡萄糖→酒精酵母菌一般不能直接利用淀粉作为碳源，特别是酿酒酵母不利用淀粉。酒酿是用糯米制作的，淀粉需要先转化成酵母菌的可发酵糖，即糖化。•若作酒醴，尔惟麴蘗——《尚书》（武丁评价傅说）•醴，甜酒。小人之交甘若醴——《庄子》•酒醴异气，饮之皆醉——王充•蘗，发芽的谷物，含有丰富的淀粉酶和糖化酶如用麦芽生产啤酒时糖化剂糖化剂？酿酒酵母原理淀粉可发酵糖酒精啤酒的酿造原理酵母麦芽汁干燥粉碎麦芽粉麦芽麦芽糖饴无氧麦芽，酵母，啤酒花和水原料原理淀粉酶麦芽糖麦芽糖酒精酵母菌一般不能直接利用淀粉作为碳源，特别是酿酒酵母不利用淀粉。酒酿是用糯米制作的，淀粉需要先转化成酵母菌的可发酵糖，即糖化。•若作酒醴，尔惟麴蘗——《尚书》（武丁评价傅说，傅说举于版筑之间）•醴，甜酒。小人之交甘若醴——《庄子》•酒醴异气，饮之皆醉——王充•蘗，发芽的谷物，含有丰富的淀粉酶和糖化酶•麴，霉变的谷物。麹中含有丰富的霉菌和酵母菌等微生物。霉菌产生淀粉酶和糖化酶。麹是中国人民的伟大发明。糖化剂？酿酒酵母原理淀粉可发酵糖酒精大麹，即麦麹，用大麦、小麦等制作，个体较大，酿造大麹酒。大粬的菌群更丰富。小麹，米麹或酒药，米粉加草药制作，个体较小，酿造米酒、酒酿和小麹酒。传统的麹麹霉变谷物。小麹西晋，米粉加辣蓼草、蛇麻花等，粉碎做块状或球状，培养——《南方草木状》小麹宋，人工接种（以旧麹末逐个为衣——《北山酒经》）——神曲工艺一直延续到现在——传统制麹现代麹：浓缩甜酒曲、强化麹等。辣蓼草小麹小麹酒酿米饭经小麯发酵，固液混合物。米酒/黄酒长时间发酵，去糟，过滤/杀菌。酿造酒/蒸馏酒/配制酒米酒——米烧葡萄酒——白兰地啤酒——威士忌酿造酒酒精不超过20%。李白斗酒诗百篇。酒精3～5%，酒斗，小斗，大概4瓶啤酒。“汝阳三斗始朝天”“焦遂五斗方卓然”酒酿发酵的原理酒酿和米酒淀粉葡萄糖酒精霉菌酵母酵母麦芽糖酒精酶淀粉麦芽糖麦芽汁干燥粉碎麦芽粉麦芽麦芽糖饴无氧霉菌酵母淀粉葡萄糖酒精酵母葡萄糖酒精无氧酒酿啤酒葡萄酒根霉属毛霉属产生匍匐菌丝无匍匐菌丝匍匐菌丝上生出假根无假根孢囊梗从匍匐菌丝上生出，与假根对生孢囊梗直接由菌丝体上生出孢子囊内具囊轴和囊托。成熟后释放孢囊孢子，不留下囊领。孢子囊内具囊轴，无囊托。成熟后释放孢囊孢子，留下囊领。显著糖化酶活性（酿酒）显著蛋白酶活性（豆豉）根霉属和毛霉属区别二、小麹中的微生物及其特征黑根霉菌落黑根霉和米根霉的形态特征米根霉菌落孢囊梗孢子囊匍匐菌丝假根黑根霉个体形态米根霉个体形态PDA平板菌落WL琼脂平板菌落个体形态酿酒酵母东方伊萨酵母酿酒酵母和东方伊萨酵母形态特征基因组（G+C）mol%：2%，可能是一个种；5%，不同种。基因组DNA杂交：同源性70%可能是一个种，20%可能是一个属。代表性基因片段同源性：16srRNA序列，ITS基因序列鉴定真菌。全基因组序列分析：最终标准。表型特征遗传特征形态特征：个体形态特征和群体形态特征（主要是菌落特征）。生理生化特征：利用碳源产酸，水解酶活性，产生特定化合物，生长的温度范围、pH范围等。其他特征：化学组成、地理分布和血清型等。微生物的分类鉴定特征18sITS15.8sITS226s正向引物ITS1ITS4反向引物rDNADNA条形码（DNAbarcode），用于识别生物物种的DNA片段。ITS优势两端保守，适合通用引物。长度合适，多拷贝，适合扩增和分析。非编码序列，丰富的多态性能较好地体现种属间差异。用ITS序列分析鉴定酵母菌ITSInternalTranscribedSpacer，内部转录间隔区。提取基因组DNAPCR，产物电泳检测NCBIBlast，选typematerial下载同源序列，MEGA比对构建系统进化树，确定种属斜面培养酵母菌PD1裂解+PD2实验教学中心网站录像实验教学中心网站录像送公司测序ITS鉴定的流程CandidaasparagiCBS:9770(KY101945)CandidaasparagiAS2.2526(AY450921.1)Y17-4ClavisporareshetovaeCBS:11556(KY102569)CandidaakabanensisCBS:7878(KY101829)CandidablattaeATCCMYA-4360(NR111407)9885948910099980.01CandidafructusCBS:6380(KY102093)CandidafructusMUCL29830(NR111292)ClavisporalusitaniaeCBS:6936(KY102562)ClavisporalusitaniaeATCC42720(EF108246)图1PCR产物电泳图2酵母菌株Y17-4ITS序列的系统进化树（NJ法，bootstrap值500）MarkerG12222932486162小麹制作酒酿分离、纯化酵母菌和霉菌霉菌个体形态鉴定，WL平板识别酿酒酵母和ITS序列鉴定用霉菌和酵母菌制备酒酿，比较色香味等用小麹制作酒酿用小麹分离霉菌PDA纯化霉菌，菌落特征霉菌个体形态观察和鉴定PDA分离酵母菌，WL纯化酵母菌菌落特征和识别酿酒酵母，个体形态酵母菌的ITS序列鉴定小麹饭饭饭饭霉菌扩大培养酵母菌扩大培养酒酿制作和关键微生物分离实验流程酒酿D0D3糖类：淀粉残留、糊精、寡糖和单糖；酒精：2%或更高，不宜作为产妇食品；风味物质（香气）：酸、醇、酯和醛等；其他营养物质：氨基酸，微量元素。用纯种微生物制作的酒酿小麹(醪+酒+更香)霉菌(醪)酵母(无变化）霉菌加酵母(醪+酒)成功关键促进米根霉快速生长，控制杂菌生长。麹好糖化活力高。饭好选用优质糯米，饭熟透，不能过烂，透气性好，适度湿润。干净环境干净，器皿洁净无油。条件合适温度、湿度、透气性和时间。小麹制作酒酿。分离、纯化酵母菌和霉菌。霉菌个体形态鉴定，酵母菌WL平板识别酿酒酵母和ITS序列鉴定。用霉菌和酵母菌制备酒酿，比较色香味等。认识传统工艺感受传统魅力用小麹制作酒酿用小麹分离霉菌PDA纯化霉菌，菌落特征霉菌个体形态观察和鉴定PDA分离酵母菌，WL纯化酵母菌菌落特征和识别酿酒酵母，个体形态酵母菌的ITS序列鉴定小麹饭饭饭饭霉菌扩大培养酵母菌扩大培养酒酿制作和关键微生物分离实验流程1.用传统工艺中生产小麹，从微生物学的角度看，辣蓼草的作用是什么？2.用浓缩甜酒药（纯种米根霉）制作酒酿，比传统小麹制作酒酿，有哪些优势和不足。3.好的酒酿甜酸可口，酸从哪里来？思考题谢谢