实验二植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术,了解细胞骨架的结构,学会制作永久封片。二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时,因其非离子型表面活性剂的特性,可以除去可溶性蛋白质和脂类,而微丝束属不可溶性蛋白,就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时,在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架,在质膜下还能见到丝状骨架,骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝,但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定,又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨,因此看到的是由微丝组成的纤维束,直径约在40nm左右。三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材普通光学显微镜,50ml烧杯,滴管,试剂瓶,载玻片,盖玻片,镊子,染色板,吸水纸,擦镜纸。五、实验药品1.M—缓冲液:所含各成分终浓度为50mmol/L眯唑,50mmol/LKCL,0.5mmol/LMgCl2,lmmol/LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸),0.1mmol/LEDTA,lmmol/L巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT)。lmol/LHCl调pH到6.820.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法:0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3.1%TrltonX—100,用M—缓冲液配制。4.0.2%考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为:甲醇:冰醋酸:水(46.5:7:46.5)。·5.3%戊二醛溶液,用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制6.50%,70%,95%乙醇。7.叔丁醇8.正丁醇9.二甲苯。10.中性树胶。六、实验步骤1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小,取若干片,置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中,用镊子轻按入使其浸没5min。2.吸去磷酸盐缓冲液,用l%TritonX—100处理20—30min。3.吸去TrironX—i00液,用M-缓冲液洗3次,每次10min左右。4.用3%戊二醛固定0.5h。5.再用磷酸盐缓冲液洗3次,每次10min。6.0.2%考马斯亮蓝R250染色20—30min(在染色板上)。7.用蒸馏水洗1—2次,将样品置于载玻片上,在普通光学显微镜下观察,先低倍,再高倍,最后用油镜。8.如观察结果较佳,可制作永久封片:在有样品的50ml烧杯中,依次用如下试剂处理:50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇,(1/2)V95%乙醇+(1/2)V叔丁醇,叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇,正丁醇,二甲苯,二甲苯(每个步骤5—10min)。然后,将样品置于载玻片上展开,镜检后滴一滴中性树脂,盖上盖玻片。