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实验二植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。五、实验药品1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／LKCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸)，0.1mmol／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT)。lmol／LHCl调pH到6.820.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3.1％TrltonX—100，用M—缓冲液配制。4．0.2％考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。·5.3％戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制6.50％，70％，95％乙醇。7.叔丁醇8.正丁醇9.二甲苯。10.中性树胶。六、实验步骤1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。2．吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。3.吸去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。4.用3％戊二醛固定0.5h。5.再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。6.0.2％考马斯亮蓝R250染色20—30min（在染色板上）。7.用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。8.如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V95％乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤5—10min)。然后，将样品置于载玻片上展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。