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实验三叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二、实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。三、实验材料新鲜菠菜叶四、实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。五、实验药品匀浆介质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／LTris—HCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心l.洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。2.加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。4.滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。5.在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。7．离心8000r／min，20min。8.取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧光显微镜观察。(二)菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。七、实验结果(一)叶绿体的分离和观察1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.以Olympus荧光显微镜为例，在选用B《blue》激发滤片、B双向色镜和0-530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。（二）菠菜叶手切片观察1．在普通光镜下可以看到三种细胞，(1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。(3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3．用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发绿色荧光，气孔仍为绿色。