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实验四细胞组分的分离一、实验目的掌握分级分离方法。二、实验原理利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将各组分逐级分离出来。三、实验材料小鼠(30克)取肝脏四、实验器材同实验七外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速冷冻离心机。五、实验药品匀浆介质(0.25mol/L蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一詹纳斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml，0.25mol/L蔗糖溶液中)。其中0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：0.lmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)10ml，0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。六、实验步骤1.低速离心分离细胞核(1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。，(2)称取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质洗涤数次。(3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至Corex离心管中，同时制备l张滤液涂片，做好标记，自然干燥。(4漓心机上500r／min离心5min(4℃)，将上层溶液吸入2支eppendof管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。沉淀物作进一步处理。(5)用5ml匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以1000r／min离心10min(4℃)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml匀浆介质，用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记，自然干燥。2.高速离心分离线粒体(1)将步骤l(4)中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以10000r／min离心5min，缓缓吸出上清液至另2eppendorf管，留取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。(2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r／min离心5min。(3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。3．分离物的鉴定(1)细胞核。将步骤l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min，吹干，滴姬姆萨染液(原液用1／15mol磷酸缓冲液稀释10—20倍)染色10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜下比较观察涂片。(2)线粒体。在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红—詹纳斯绿染液，取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片上，染色30min后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。附：更精致的分离方案将4.5ml0.34mol／L蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入4.5ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700×g离心10min，得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml0.25mol／L蔗糖溶液洗2次，每次1000×g离心10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层，经700×g离心10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。（2）细胞核纯化：将沉淀用5倍体积的0.34mol／L蔗糖0.5mol／LMg(Ac)2溶液混悬，铺在4倍于核悬液体积的0.88m01'／L蔗糖—0.5mol／LMg(Ac)2溶液之上，1500×g离心20min，沉淀物即为纯化的细胞核。（3）分离核仁：纯化的细胞核混悬在2倍体积的0.34mol／L蔗糖—0.5mol／LMg(Ac)2溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质pH中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于4倍体积的0.88mol／L蔗糖—0.5moI／LMg(Ac)2溶液之上，1700×g离心17min。沉淀物即为核仁，溶液为上清液I。将上清液I10000×g离心lOmin得上清液Ⅱ和沉淀物，沉淀物以lOml预冷的0.25mol／L蔗糖溶液洗2次，每次10000×g离心10min，得沉淀物即为纯化的线粒体。上清液Ⅱ经16300×g离心20min得上清液Ⅲ和沉淀物，沉淀物以lOml预冷的0.25m01／L蔗糖溶液洗；16300×g离心20min，得沉淀物即为纯化的溶酶体。上清液Ⅲ经100000Xg离~~'30min，得沉淀物(为微粒体)和上清液Ⅳ，后者再经离心150000×g3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分子等。