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实验五四膜虫纤毛的再生一、背景和原理纤毛和鞭毛是细胞表面的特化结构，具有运动功能。纤毛和鞭毛的结构基本相同。纤毛轴心含有一束“9＋2”排列的平行微管，中央微管均为完全微管，外围二联体微管由A，B亚纤维组成，A亚纤维为完全微管，由13个球形亚基环绕而成，B亚纤维仅由10个亚基构成，另3个亚基与A亚纤维共用(图9-16)。微管是由微管蛋白组成的管状结构，对低温、高压和秋水仙素敏感。大多数微管纤维处于动态的组装和去组装状态，这是实现其功能所必需的过程。本实验以Rosenbaum和Carlson（1969）的实验为基础，在降低pH和钙离子存在的条件下通过机械修剪的方法，在膜水平脱去四膜虫的纤毛，剩下肿胀的，不能运动的细胞。在不同的生长温度（25℃和17℃）下观察纤毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微管亚单位的合成和组装。二、实验目的1．使用相差显微镜和血球计数器；2．了解微管组装的基本原理三、教学安排学时数：3－4小时。四、实验仪器、器材与试剂1．材料：梨形四膜虫。2．仪器：锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm膜，载玻片，盖玻片，定时器。3．试剂：蛋白胨，亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA，醋酸钠，氯化钙。五、实验方法与步骤1、分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25℃和17℃培养。（时间）2、两瓶培养物分别800g离心10分钟，重新悬浮于15毫升1%蛋白胨溶液，置于50毫升锥形瓶，做好标记。3、准备2个50毫升锥形瓶，各加入15毫升1%蛋白胨溶液；3个100毫升锥形瓶，含20毫升1%蛋白胨溶液，分别加入10微克/升亚胺环己酮；50微克/升亚新霉素；加入2毫克/升秋水仙碱。4、以下操作在冰浴上进行：1）在零时间，用一个大试管在冰浴上将2.5毫升浓缩的四膜虫悬液（生长于25℃）加至5毫升介质A（10mMEDTA·2Na;50mM醋酸钠；pH6.0）中，搅拌混匀。2）30秒后加入2.5毫升预冷的蒸馏水。3）1分钟后加入0.25毫升预冷的0.2McaCl2,parafilm膜封口，倒转试管使之混合。4）2分钟后用装有19号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中（修剪掉四膜虫的纤毛）。迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。5）去纤毛后，立即把1毫升去纤毛的细胞加至20毫升1%蛋白胨溶液，25℃预热的100毫升锥形瓶中，于25℃培养并开始实验。5、每隔10分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性（motility）%进行分析。由于脱纤毛的细胞不能运动，切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察，估计运动细胞和非运动细胞的数目。制备快速标本，在相差显微镜下观察细胞是否肿胀，有无新生纤毛等情况。6、同时对生长于17℃的四膜虫进行脱纤毛，并同在25℃的四膜虫的纤毛再生时间比较。7、从生长于25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。8、从生长于17℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。9、从生长于25℃的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。对下列各个瓶中分别加入1ml脱纤毛细胞：（i）蛋白胨＋10µg/ml亚胺环己酮（ii）蛋白胨＋50µg/ml新霉素（iii）蛋白胨＋2mg/ml秋水仙碱（iv）只含蛋白胨作为对照每隔10分钟从瓶中取样。让实验进行尽可能长的时间，以便观察其反应是否发生改变。记录结果实验结果以能动性（％）对时间（min）作图表示：（1）生长于25℃和17℃的四膜虫；（2）抑制物对纤毛再生的效应。讨论作为这一实验的引伸，还可以应用更多的抑制物来表明，是否需要生成新的信息性分子，细胞周期中的不同时相是否起重要作用？对抑制物的观察可以时可逆的，因为经过一个时间阶段后，细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。这些实验着眼于纤毛的再生系统，在这些系统中很容易辨认出重点。这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提供资料。六、实验提示与注意事项1.梨形四膜虫的纯培养可培养于1％蛋白胨（1％蛋白胨；0.25％酵母浸膏），培养液用15磅/时2高压灭菌15分钟。在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术，但在课堂实验时无需应用无菌采样技术。为了获得实验所需数量的培养物，含250ml蛋白胨的500ml锥形瓶在25℃可培养1－2天，而在17℃需2－3天。这一体积的培养物可用来接种25瓶新的250ml培养物。2．生长的温度很重要；如果四膜虫没有在25℃生长至少6天的话，则再生速率显著延缓。因此，对两种不同生长温度的比较，形成了本实验中一部分的基础。3.四膜虫的离心必须小心，因为在减速时细胞容易被漩涡卷起。如果参加实验的学生较多，或没有经验，最好在实验时由一位技术员来离心细胞。通常800g即可，但也可用1000g。七、思考题纤毛再生所需的时间，是包括微管蛋白的合成和组装在内的许多过程决定的。培养物原先生长的温度为什么能影响纤毛再生率？通过抑制物的实验结果，我们能否确定在实验过程中，纤毛再生取决于现存前体库的大小和新蛋白质合成的程度？在较低级的真核细胞中我们能学到什么有关蛋白质合成的知识？八、推荐阅读Rosenbaum,J.L.andCarlson,K.1968CiliaRegenerationinTetrahymenaanditsInhibitionbyColchicine,J.cellBiol.,40,415Rosenbaum,J.L.andChild,F.M1967FlagellarRegenerationinProtozoanFlagellates,J.CellBiol.,34,345Rosenbaum,J.L.,Moulder,J.E.andRingo,D.L.1969FlagellarElongationandShorteninginChlamydomonas,J.CellBiol,41,600