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实验六植物愈伤组织诱发培养一、实验目的掌握无菌操作进行愈伤组织诱发培养的方法。二、实验原理植物组织培养和细胞培养是进行植物细胞工程的基础工作。一般认为，分化了的植物根、茎、叶细胞具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给予合适的营养条件和激素水平，可以脱分化为愈伤组织。利用愈伤组织可以进行一些生物化学、发育学、遗传学等方面的研究工作，例如愈伤组织能进一步诱导分化成完整的植株，还可以将愈伤组织进行单细胞分离，做悬浮培养，筛选各种生化突变型。三、实验材料烟草或迎春花茎段四、实验器材培养皿，烧杯，镊子，剪刀，小三角烧瓶，大三角烧瓶，酒精灯，酒精棉花，滴管，试剂瓶，滤纸，锡箔纸，超净工作台，植物细胞培养室。五：实验药品MS固体培养基(见附录，加0．8%琼脂)：①培养基中加生长素2.4－D，为脱分化培养基，②培养基中加细胞分裂素6一BA和生长素NAA，为分化培养基，①和②其它成分相同。70％乙醇，漂白粉溶液(1片漂白粉片／加300ml水)，无菌水。六：实验步骤1．培养基的配制：MS固体培养基灭菌后稍冷，倒入无菌培养皿分装，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二层牛皮纸盖上用绳扎紧，灭菌后待用。2．迎春花枝条，去叶，用水洗茎。洗干净后剪取5cm长的枝条3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。再转入漂白粉溶液，消毒lmin。3．移入超净台，按无菌操作要求将茎段取出置于无菌培养皿内，用无菌水反复冲洗。再用无菌镊子移入另一培养皿内，再用无菌水反复冲洗。4．将茎段剪小，每段约lcm长，放入脱分化培养基，每皿6—7段，均匀分散在培养皿中，26℃暗培养3—4天，观察有无染菌。5．挑取无污染茎段，转接入新的脱分化培养基，继续暗培养7天，可观察到愈伤组织开始生长。6．如果以无菌烟草为材料，可跳过2、3两步，省去消毒、漂洗过程。直接进入第5步。取烟草叶片进培养。培养7天检查有无染菌，如有污染再转接一次，继续暗培养7天，在这阶段可以看到叶片细胞脱分化产生愈伤组织。7．将烟草愈伤组织转接到细胞分化培养基，照光培养2—3周，可以观察到细胞分化产生新的苗。