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实验七鼠肾细胞原代培养一、实验目的了解细胞原代培养的原理和方法，学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制等操作技术，观察原代细胞的形态。二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的器官组织，经消化，培养成为单个细胞的过程。用胰蛋白酶对组织进行消化获得单细胞悬液，由细胞悬液定量接种后获得原代细胞培养物。胰蛋白酶的作用是消化除去细胞间质，蛋白酶液中可添加胶原酶以增加消化能力。细胞培养是探索细胞生命活动规律一种基本的、十分有效的实验技术，通过细胞培养可以进行细胞的结构，细胞的生长发育等等各项研究，目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。三、实验材料出生后一周左右的乳鼠。四、实验器材细胞培养箱，离心机，超净工作台。细胞培养皿，滴管，血球计数板，吸液器，眼科剪刀，镊子，小离心管。五、实验药品RPMl640培养液，小牛血清，青霉素，链霉素，0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶，，75％乙醇，碘酒，乙醚，PBS，EDTA。六，实验步骤：1.按无菌操作技术，消毒超净工作台及双手。2.用乙醚麻醉法处死小鼠：将乙醚棉球放进烧杯中，然后放入小鼠，盖住杯口片刻等小鼠死亡。3.碘酒消毒腹部皮肤。4.75％酒精脱碘2次，然后进入超净工作台操作。5.用酒精消毒双手及台面。6.用第一副眼科镊及眼科剪“工”字型剪开皮肤。7.用第二副眼科剪，剪开拉开腹膜。8．推开肠管，在腹后壁找到肾脏，并剪取全肾。将剪刀放入75％酒精中浸泡，待用。9.置肾脏于灭菌的盛有PBS灭菌液的培养皿。（直径60mm）中洗两次。夹取肾组织，移至灭菌1.5ml离心管内，将剪刀在无菌PBS中洗一下，剪碎肾组织，越碎效果越好。10.加入0．25％胰蛋白酶+1％胶原酶lml，混合均匀。11.37℃作用15分钟，每五分钟轻轻弹击。12.无菌滴管轻轻吹打已消化组织20次，注意避免液体外溢。13.1000RPM，离心1分钟，沉淀未消化的组织块和残渣。14.吸取含有离散细胞的上清液至另一个管内。15.3000RPM离心2分钟，收集离散细胞。16．弃去上清液，加入完全培养液lml，吹打均匀。17．吸取l0µl，加入细胞计数板中，进行细胞计数。要求数四个角的16个小格中细胞数的总和。然后按照以下公式计算细胞密度。总计数结果*1000*稀释倍数=细胞个数/mL418.按105细胞/ml，吸取lml细胞加lml培养液，接种到35mm细胞培养皿中。19.轻轻混匀细胞，置培养皿于37℃，5％的C02培养箱中，第二天．观察，换培养液，继续培养，第四天观察结果。