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实验八哺乳动物贴壁细胞的传代培养一、实验目的了解哺乳类动物离体贴壁细胞的培养条件；掌握贴壁培养细胞的传代技术；观察传代细胞贴壁、生长和繁殖过程中细胞形态变化和形成单层；掌握细胞培养中一些常用培养基、缓冲液、消化液、抗生素、完全培养液的配制方法及各种无菌消毒方法；掌握细胞计数方法。二、实验原理要使细胞能在离体条件下存活并代代相传，必须在体外人工模拟—个类似于体内的环境。所要求的这个环境呈液态，它包含有细胞赖以生存的基本培养基、一定的渗透压和氢离子浓度(即pH)，要有足够的空间，能在恒温恒压和无菌的条件下以满足细胞群体增殖和代谢的需要。离体贴壁培养细胞当群体增殖汇合形成单层细胞群体达到饱和密度时，必须进行传代。传代过程是通过胰蛋白酶消化将细胞从培养瓶（皿）上脱落并分散成单细胞，经过稀释(或不经稀释)从一个容器上转移到另一个容器并给予新鲜培养液进行再培养。这种传代过程称为传代培养。三、实验材料贴壁培养细胞株（系）、CH0、Hela、L929、或其他细胞1-2瓶。四、实验器材设备：细胞培养箱，电热恒温干燥箱，高压消毒锅，水浴锅，离心机，冰箱，无菌室或超净工作台。器具：培养瓶(皿)3—6只，离心管2只，试管2只，滴管，5ml、10ml，移液管各若干支，血球计数板1块，污物缸，橡皮塞，吸液器，pH试纸，消毒药棉等高压或高温灭菌备用。五、实验药品RPMl1640培养基，5％NaHCO3，小牛血清，青霉素，链霉素，谷氨酰胺，0.25％胰蛋白酶液，0.1％EDTA-Na2液，75％乙醇，HCl，台酚蓝染色液，NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2P04。六、实验步骤l.洗净双手，入无菌室缓冲间穿戴工作服、鞋、帽、口罩后进入无菌室。2．点燃煤气(或酒精)灯，用75％乙醇棉球抹拭双手、操作台表面、各种试剂瓶口。3.配制有关溶液（1）RPMll640培养液：1640粉剂一袋(10.4g)＋1升millce水＋谷氨酰胺0.3g+NaHCO32g，混匀后逐滴加入0.5ml浓HCI到pH6.8，过滤灭菌，分装，-20℃保存。临用时加10％小牛血清和两种抗菌素溶液；最终浓度分别为100单位／毫升。（2）小牛血清灭活：小牛血清溶解后放置56℃，30min，然后分装小瓶，-20℃保存。（3）两种抗菌素(双抗)溶液：取青霉素80万单位和链霉素80万单位，溶于80ml无菌水中，配成每毫升1万单位溶液，4℃保存。（4）PBS溶液：NaCl4g，KCl0.lg，Na2HPO4(无水)0.57g或(12H2O)1.43g，KH2PO40.lg,双蒸水500mlpH7.2，10磅20分钟灭菌，4℃保存。（5）0.1％EDTA：l00mgEDTA＋100mlPBS（6）胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶＋l00mlPBS（7）胰酶消化液：溶液(5)+(6)，得到200ml溶液过滤灭菌。（8）细胞培养液：45ml1640培养液＋5ml小牛血清+0.5m1双抗。4消化细胞取接种3－5天形成单层的细胞株，使细胞面朝上，将培养液用吸管吸去，用1－2滴管PBS洗1－2次，加入2滴管消化液。消化1—2min，待细胞单层上出现透明针尖小孔隙时（此时镜检可见成片层的细胞固缩成圆形，细胞与细胞之间相互接触松散或互不接触)，使细胞面朝上，轻轻吸去消化液，丢入废物缸，然后加入2滴管完全培养液，吸打细胞使其成细胞悬液。如果消化过头而细胞已自行脱落时，可加少量血清或完全培养液以中止消化。滴管吸打均匀使成细胞悬液并转移至离心管离心(1000r，3—5min》后用完全培养液再悬浮。5.细胞接种取小型细胞培养瓶1只，然后加入5ml左右培养液，再将上述细胞悬液等量（1：3或1：4）或不等量（根据实验需要）接种入内，打匀、平置、编号，37℃培养，隔天观察结果。6.细胞计数胰酶彻底消化细胞，用4.5ml细胞培养液悬浮细胞后转移到试管中，加0.5ml台酚蓝染色液，滴管吸打细胞悬液使均匀，吸取细胞悬液（要充满滴管，不能有气泡）沿细胞计数板血盖片边沿轻轻滴入计数板（不能有气泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有误），在光学显微镜(10Xl0)下计数按图中四角大方格内细胞总数，按公式计算如下：4大格细胞总数*1044求出每ml平均细胞数，乘以稀释倍数为该瓶细胞总数。附录二细胞培养用液-1.平衡盐液（1）Hank液原液：取NaCl80.0g，Na2HPO4·2H2O0.6g，KCl4.0g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O2.0g，葡萄糖10.0g，无水CaCl21.4g，加水至1000ml。配制：取Hank原液100ml，加蒸馏水896ml，加0.5％酚红4ml，混匀。分装，包扎，0.0552MPa(8psi)/30min或-.0689MPa临用前，加NaHCO3液调pH至7.2。（2）D-Hank液NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O0.12g，KH2PO40.06g，葡萄糖1.0g，酚红（1％）2ml，加三蒸水至1000ml。0.0689MPa（10psi）/10min灭菌，冷却后置4℃冰箱保存。（3）Earle液原液A：取NaCl68.Og，KCl4.0g，NaH2PO4·H2O1.4g，葡萄糖10.0g，加水至500ml。原液B:取CaCl22.0g，MgSO4·7H2O2.0g，0.5%酚红4.0ml，加水至500ml。配制：取原液A、B各1份，加18份水混匀。分装，包扎，0.0552MPa（8psi）/30min或0.0689MPa(10psi)/15min灭菌，置4℃冰箱备用。临用前调pH。2.培养液（1）M199粉末9.9g加水至1000ml。过滤灭菌。（2）Eagle’sMEM：取E-MEM9.9g，水加至1000ml，分装，0.1034MPa（15psi）/15min灭菌。使用前每100mlE-MEM液中加入1ml3％谷氨酰胺。（3）RPMI1640：取RPMI1640干粉10.5g，加水至1000ml，CO2气体调至pH7.2，过滤灭菌。（4）DMEM：取DMEM干粉9.96g，水加至1000ml，CO2气体调至pH7.2，过滤除菌。