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实验九培养细胞的染色体显示一．实验目的以传代培养的细胞为材料，学习和掌握细胞染色体显示的基本原理和方法．二.实验原理显示染色体主要是显示分裂中期细胞，因为细胞处于分裂中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段．哺乳动物细胞内有几十条染色体，相互交错缠绕，密集在细胞中，必须把它们分散开，才便于观察．采用加入秋水仙素，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经离心，低渗处理，固定，滴片等步骤，可以制备出较好的细胞染色体标本。培养细胞有来源易得，细胞分裂率高和制出标本清晰度高等优点，是制备染色体极好的材料。三．实验材料传代培养的L929细胞株。四.实验器材细胞培养瓶，载玻片(预冷保存)，盖玻片，10mi离心管，玻璃滴管，37水浴锅，低速离心机，镊子，培养皿，牙签五.实验药品1．PBS溶液2．DMEM或1640培养液(含10％小牛血清)3.秋水仙素：10µg/ml4．0.075MKCl溶液5.固定液：醋酸：乙醇＝1：3(用前新鲜配制)6．Giemsa染色液：0.6gGiemsa粉末加入50ml甘油，置于55-60℃水浴2小时，加入甲醇50ml,静置1天以上，过滤后保存于棕色瓶内，使用时用PBS作十倍稀释。六、实验步骤1．培养细胞：在细胞培养瓶中，将细胞培养至80-90％的单层。2.加秋水仙素：向细胞培养液中加入秋水仙素，终浓度为0.6µg／ml，细胞置于37℃培养箱继续培养18小时。3．收集细胞：吸去细胞培养液，加入3ml胰蛋白酶，彻底消化，1500rpm，离心10分钟。，4.低渗处理：吸去上清液，加入预温至37℃的0.075M的KCl溶液5ml，在温箱中静置45分钟。5.预固定：向细胞悬液中加新鲜1：3醋酸－乙醇固定液lml，用吸管吹打调匀1500rpm离心5分钟。6.固定：轻轻地吸去上清液，将新鲜固定液5ml沿离心管壁逐滴慢慢加入，然后轻轻吹打均匀，固定20分钟，1500rpm，离心5分钟，轻轻地吸去上清液。7．滴片：细胞悬于0.2---0.5ml固定液中，将细胞悬液滴于事先预冷的载玻片上，每片2---3滴，滴片时的距离保持半米高度，滴片后立即用嘴向片子上吹气，使细胞分散均匀，将载玻片掠过酒精灯几次，以助于染色体分散和展开，室温下下干燥。8.染色：用PBS稀释10倍的Giemsa染色液染色20分钟，水洗，室温下晾干。9.镜检。