复旦药物分析课件04药物的含量测定方法与验证

第四章药物的含量测定方法与验证分析方法方法优点方法缺点适用对象容量分析法简便、准确度好、精密度高专属性差化学原料药含量测定光谱分析法简便、快速、灵敏度高专属性差制剂中溶出度、释放度测定色谱法灵敏度高、专属性好操作相对复杂（低）制剂的含量测定定量方法特点：第一节定量分析方法的分类与特点一、容量分析法（一）容量分析法的特点操作简单、快速；比较准确（RSD＜0.2%）；仪器普通易得。1.滴定度（T）的概念每1ml滴定液相当于被测物质的量(mg)2.滴定度的计算aA+bBcC+dDT=M×a/b×B3.百分含量的计算（原料药）（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%F=实际浓度/规定浓度（二）容量分析法的有关计算（2）剩余滴定法%mFVVTs）（百分含量T——滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数V——滴定时，供试品消耗滴定液的体积（ml）V0——滴定时，空白消耗滴定液的体积（ml）F——浓度校正因子ms——供试品的质量双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.05ml。计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量144.1。%04.100%10010003220.041.141.01062.005.21%100%WVfT含量司可巴比妥的含量测定：取供试品0.1301g，置碘量瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min，暗处静置15min后，加碘化钾试液10ml，立即密塞摇匀，用0.0999mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.1mol/L)相当于13.01mg的司可巴比妥。计算含量%9.99%10010001301.001.131.00999.005.1505.25%）（含量片剂含量测定结果的计算%100/%100%片）标示量（）平均片重（）供试品重（）测得量（标示量每片含量标示量gggg%100%标示量平均片重标示量smTVF烟酸片含量测定取本品10片精密称定为3.5840g，研细，精密称取0.3729g，置100mL锥形瓶中水浴加热溶解后，放冷。加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1005mol/L)滴定至粉红色消耗25.02mL。每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当12.31mg的烟酸。求供试品中烟酸的标示百分含量（标示量0.3g/片）。标示量%=V×T×F×平均片重W×标示量×100%=25.02×12.31/1000×0.1005/0.1×0.35840.3729×0.3=99.17%×100%二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm)灵敏度高，可达10-7g/ml～10-4g/ml1.特点准确度高，RSD（%）2%仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广2.定量：朗伯-比耳定律A=E1%1cmCl3.仪器校正和检定波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)E1%1cm124.5144.048.62106.6杂散光检查：试剂浓度(g/ml)测定波长透光率(%)NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.84.对溶剂的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶剂+吸收池A＜0.40＜0.20＜0.10＜0.055.测定方法要求供试品溶液的A应在0.3～0.7对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%常用方法吸收系数法：含量%=(E1%1cm)x/(E1%1cm)r×100%计算分光光度法：VitA的三点校正法比色法硫喷妥钠的含量测定：取供试品0.2500g，用水稀释至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀释至100ml，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用0.4%NaOH溶液配制浓度为5.0µg/ml作为对照品溶液。照分光光度法，在304nm波长处分别测得供试品和对照品的吸收度为0.520和0.545，已知1mg硫喷妥相当于1.091mg的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量对供对供AAcc对照品比较法%1.104%10025.010500100091.1545.0520.00.5%6（2）吸收系数法100)g/ml()g/100ml(1%1cm1%1cm%1cm1lEAclEAcclEA%mVnlEAs%cm百分含量对乙酰氨基酚的含量测定方法为精密称取本品40.1mg，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀。在257nm的波长处测定吸收度为0.570，按C8H9NO2的百分吸收系数为715计算。%4.99%1001.40100050100100715570.0%（二）荧光分光光度法灵敏度高，可达10-12g/ml～10-10g/ml在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用1.特点用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减灵敏度高，但干扰因素多。制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少。2.荧光分析仪有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3.含量测定常用的方法为对照品比较法:Cx=(Rx-Rxb)/(Rr-Rrb)×CrCh.P2010收载利血平片三、色谱分析法色谱分析法的特点与适用范围高灵敏度，可达10-15g/ml～10-12g/ml高专属性，强分离能力高效能，可多组分同时定量分析色谱法分类：PC；TLC；柱色谱；GC，HPLC高相液相色谱法分类：吸附；分配；离子交换；排阻色谱等。高效液相色谱仪色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用方法有关。正相HPLC：极性填充剂，弱极性流动相反相HPLC：固定相极性小于流动相极性，大多C18柱、甲醇、乙腈、水（缓冲液）作流动相。一般色谱柱使用温度不超过40℃，流动相pH控制在28之间。检测器作用——用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。目前最常用的检测器主要有：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器二极管阵列检测器色谱图常规色谱图三维色谱图光谱图1.对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5灵敏度：定量信噪比10；定性3重复性：RSD≤2%拖尾因子：T=W0.05h/2A应在0.95～1.05系统适用性试验正常峰和不正常峰如何判断？用拖尾因子（对称因子）：TT=W0.05h/2A对内标物要求：a．内标物须为原样品中不含组分b．内标物与待测物保留时间应接近且R1.5c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质siisAAmm和测混匀进样过程：校正因子（f）=AS/CSAR/CR含量（CX）=fA’S/CS’AX3.测定方法：内标法内标法优点：进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关。内标法缺点：制样要求高；须寻找合适内标物测定方法：外标法，有外标标准曲线法和外标一点法外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量前提：截距接近0，对照品浓度与待测组分浓度接近RXRxAACC)(含量外标法特点：1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大→每次进样量应一致，否则产生误差例：醋酸氢化可的松的含量采用HPLC法测定：取本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每ml约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg，样品取样为35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中药物和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量内标一点法%4.97%100355.0/346.0%346.03.061228455221345352.1352.1362.054678243.06125843''SSXXRRSSCAAfCCACAf需验证的分析项目1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.原料或制剂中有效成分含量测定；4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。第二节药物分析方法的验证一、准确度是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度1.原料药可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。具体操作：取高、中、低三个浓度，每个浓度三个样本,共9个数据来评价，回收率的RSD＜2%；UV和HPLC法，一般回收率可达98%～102%；容量法回收率可达99.7%～100.3%%100-%加入量本底量测得量）加样回收率（%100%加入量测得量）回收率（对于化学药，一般中间浓度加入量与供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右；建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.2:1，1:1，0.8:1左右，应报告已知加入量的回收率（％)。对于中药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右，高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.5：1，1:1，0.5：1左右，应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（％)计算值，以及相对标准偏差（RSD%)。浓度选择：二、精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重复性、中间精密度及重现性1.重复性在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。3.重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。三、专属性是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定色谱法和其他分离法，应附代表