复旦药物分析课件05体内药物分析

第五章体内药物分析体内药物分析特点1、体内药物组成复杂，包括原形药物、I相代谢产物及原形药物或I相代谢产物与葡萄糖醛酸形成的II相代谢产物(缀合物）、蛋白结合物等；2、被测药物、代谢物、缀合物的浓度低；3、干扰物质多，内源性物质、同时服用的其他活性物质种类繁多；样品大多需要分离和净化样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）；样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率体内药物分析：第一节、常用体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类、采集与制备（一）血样：血浆、血清血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。血浆的制备：采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆。抗凝剂—最常用的是肝素（heparin），肝素是体内正常成分，因此不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰药物的测定。通常1ml血液需用肝素0.10.2mg或20IU(1mg126IU)。可不必准确控制其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中的钙离子结合的试剂，它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定，不常使用。血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在25003000r/min离心510min，上层淡黄色液体即为血清。现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游离的和血浆蛋白结合的总浓度）。血浆与血清的区别血清比血浆只是少一种纤维蛋白原一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%（血清为全血的40%左右），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。（二）尿样：尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。尿药浓度变化较大，一般以某一时间段或单位时间内尿中药物的总量表示。成人一日排尿量为15L。尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）。尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性较差、尿液量较大不易保存等。（三）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度。唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成前两者分泌量占总量90%。两者中浓度大致相当。取样：在潄口后15min，安静状态下采集口腔内然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)，如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集。采集的唾液离心取上清供测定。药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、肺、心等。制备：测定之前一般需制成匀浆组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法（蛋白水解酶）（四）组织：（五）头发：应用—体内微量元素含量测定—用药史的估计—临床用药和药物非法滥用的区别—毒性药物检测头发样品的采集：采集枕部发样(带根部），微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高。头发样品的洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次。头发样品的处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）三、体内样品的贮存与处理（一）冷藏与冷冻血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过2h，分离后再置冰箱或冷冻柜中保存（-20~-80℃）。尿样应立即测定，若收集24h的尿液不能立即测定时，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存24~36h，也可加入叠氮化钠较长时间保存。唾液在保存过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻（二）去活性终止酶的活性方法：快速冷冻、微波照射、加入酶活性阻断剂等。一、体内样品预处理的目的1、使待测药物游离：将药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度。2、满足测定方法的要求：介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物3、改善分析环境：为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测灵敏度和选择性。第二节、体内样品处理全血/血浆/血清/尿液/粪便/组织样品处理方法选择蛋白沉淀法（药物及其代谢物）分离与浓集法缀合物水解（II相代谢产物）化学衍生化法（药物分子含活泼氢）液液萃取法（亲脂类药物及其代谢产物）固相萃取法（药物及其代谢产物）超滤法（游离药物）样品预处理方法的选择分析方法选择免疫分析法（生物大分子药物）体内/生物样品无需样品处理需样品处理色谱分析法无需样品处理生物学方法（抗生素类药物）气相色谱及其联用技术GCGC-MSGC-MS/MS(低挥发性、易挥发药物及其代谢产物）薄层色谱法TLC（不易挥发药物及其代谢产物）高效液相色谱及其联用技术HPLCHPLC-MSHPLC-MS/MS(不易挥发药物及其代谢产物毛细管电泳及其联用技术CECE-MSCE-MS/MS(不易挥发药物及其代谢产物）分析方法与样品处理步骤的选择二、常用体内样品处理方法要考虑：药物的理化性质（极性、酸碱性、光谱特性、挥发性、稳定性），药物测定的目的，选用的生物体液和组织的类型，待测物的浓度范围，样品制备与分析技术的关系。（一）蛋白沉淀法是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。1、加入可与水混溶的有机溶剂（体积比、pH值）破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。2、加入中性盐使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用3、加入强酸与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。4、热凝固法加热至90℃蛋白热变性后离心或过滤除去（二）分离与浓集当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。1、液相萃取法溶剂选择—合适的溶剂是成功的主要条件①了解药物与溶剂的化学结构及其性质②对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶③沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶④不影响紫外检测⑤具有较高的化学稳定性和惰性⑥不易乳化24化合物名称极性粘度沸点吸收波长Hexane(正己烷)0.060.3369210Cyclohexane(环己烷)0.1181210Toluene(甲苯)2.40.59111285Ethylether(乙醚)2.90.2335220Methylenechloride(二氯甲烷)3.40.4440245Ethylacetate（乙酸乙酯）4.300.4577260Chloroform(氯仿)4.40.5761245提取溶剂：极性相似相溶溶剂的用量：一般有机相与水相之比为1：1~5：1溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。酸性药物pH应低于药物pKa值1~2个单位；碱性药物：pH应高于药物pKa值1~2个单位。提取：进行一次（至多二次）提取，浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来。空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少。液液萃取特点：优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、可使样品富集、可一次进行多个样品萃取缺点：乳化、污染环境、乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心。2、固相萃取法：以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取活化上样淋洗洗脱洗脱液浓集29固相萃取的模式及原理反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取①阴离子交换②阳离子交换活化固定相上样淋洗洗脱实验步骤第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱—除去大部分甲醇第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析血浆样品可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min33本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。固相萃取特别适用于极性较大、水溶性较大、稳定性较差、不宜用过强的酸碱处理的药物。柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术。基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析。自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法3.超滤法膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度按照分子截留量的大小，可分离301000kD的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。超滤法特点：不引入有机溶剂、破坏小。游离药物分析的首选方法（三）辍合物的水解：酸水解法：强酸、加热酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5，37℃孵育数小时。溶剂解：（四）化学衍生化1、使药物变成能被分析的性质2、提高检测灵敏度3、增强药物稳定性4、提高对光学异构体分离的能力气相色谱衍生化液相色谱衍生化衍生化方法：柱前衍生，柱后衍生气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化第三节、体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立（一）分析方法的选择1、色谱分析法2、免疫分析法3、生物学方法分析方法检测限度/10-8g/ml特异性/分离能力紫外分光光度法（UV）100－荧光分光光度法（Fluor）0.1±原子吸收分光光度法（AA）0.1+气相色谱法氢火焰离子化检测器（FID1～10++氮磷检测器（N-PD）0.1～0.01+++电子捕获检测器（ECD）0.01+++质谱检测（MS）0.001++++液相色谱法紫外检测器（UV）100++荧光检测器（Fluor）0.1+++电化学检测器（ECD）0.01-0.001+++质谱检测（MS）0.001++++免疫法0.001++常用分析方法（二）分析方法建立的一般程序1、色谱条件的筛选：确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和适当的保留时间(tR)。2、色谱条件的优化：在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：空白溶剂试验——溶剂(方法特异性)空白生物基质试验——内源性物质干扰(方法特异性)模拟生物样品试验——方法验证（效能指标）3、试验样品的测试：考察代谢物的干扰，进一步评价方法的专属性二、分析方法的验证1．选择性——避免干扰2.残留3.标准曲线与线性范围4．定量下限——灵敏度5．精密度与准确度——结果可重现6．稀释可靠性7.样品稳定性8．提取回收率9.基质效应准确度精密度专