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第四篇细胞与医学遗传综合实验第一章细胞生物学综合实验包括人类在内的生物体都是由细胞组成的，细胞是生命的基本单位。正常生物体内细胞的诞生和死亡多处于一个动态平衡状态，如果这种平衡被破坏，生物个体将会患病。以人为例，如果该死亡的细胞没有死亡，就可能导致细胞恶性增长，形成肿瘤。如果不该死亡的细胞过多地死亡，比如受艾滋病病毒的攻击，不该死亡的淋巴细胞大批死亡，就会破坏人体的免疫能力，导致艾滋病发作。目前，人类对于疾病的治疗也从先前的对症治疗转向对因治疗，因而很多治疗往往以细胞为靶点。对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。体外培养的细胞是细胞生物学和分子生物学研究的一个常用材料。无论是细胞系还是原代培养细胞均具备容易操作，易于观察等特点，而且又在一定程度上保存着与体内细胞相同的基本结构和功能，因而常被用来建立多种细胞损伤（UV射线、缺血、药物或某些化学物质等）或细胞保护模型（蛋白的上调或下调表达，药物等）。随后通过多项研究进行从现象的观察到机制的探讨，为各种生理病理现象乃至临床治疗提供一定的理论基础。脑缺血是人体内常见的会导致严重后果的病理状态，缺血神经元损伤的机制日益受到人们的关注，人们也在寻找更好的保护神经元的方法。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（ratadrenalpheochromocytoma,PC12）细胞是最常用的神经细胞模型。缺糖（GlucoseDeprivation，GD）是缺血过程中关键因素，因此本实验旨在通过检测缺糖对细胞的影响，以及缺糖损伤保护性药物谷氨酰胺对细胞的保护作用，从而为类似的研究提供一定的范例。选用PC12细胞进行相关研究，分为正常组（正常培养），损伤组（缺糖培养），保护组（缺糖培养的同时进行谷氨酰胺处理），并选择合适的时间点（GD3h,6h,12h,24h等）进行相关指标的检测。其中正常组是指正常培养条件下的PC12细胞；损伤组是给予PC12细胞缺糖培养，培养至相应的时间点；保护组是指在PC12细胞缺糖培养的同时给予缺糖损伤保护性药物谷氨酰胺处理。在相同的时间点首先观察了缺糖对PC12细胞的损伤以及谷氨酰胺对细胞的保护作用，主要进行了形态学观察以及细胞活力等检测；随后对观察到的现象做进一步的机制探讨。已有的研究表明，缺糖可引起细胞凋亡，而谷氨酰胺可以抑制细胞的凋亡。因而预期观察到的现象应该是在相同的缺糖时间点，损伤组细胞活力明显低于保护组和正常组；细胞凋亡率明显高于保护组和正常组。细胞在多种应激作用下往往会启动内源性凋亡通路，引发随后的细胞死亡。细胞色素c（Cytochromec,CytC）和其他促凋亡因子从线粒体向胞浆的释放是内源性凋亡通路中关键的控制因素。Bcl-2家族成员是调节内源性凋亡通路的线粒体上游分子，可以通过控制CytC的释放影响凋亡的进程。Bax是Bcl-2蛋白家族中的一个促凋亡蛋白，其表达增加或构象改变后易位到线粒体，促进了线粒体外膜的通透性转换孔的形成和开放，从而释放出CytC和凋亡诱导因子，激活内源性细胞凋亡途径。为此进一步探讨了缺糖诱导细胞凋亡以及谷氨酰胺抑制缺糖诱导细胞凋亡的机制，主要检测了CytC的释放以及Bax表达和构象改变。已有的研究还表明，多个信号通路（Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/AKT通路等）的活化可以作用于Bcl-2家族成员Bax从而调控细胞凋亡，因而可通过特异性的通路抑制剂和WB技术探讨多个信号通路与缺糖诱导细胞凋亡及谷氨酰胺细胞保护过程中的关系。技术路线图如下：图4-1-1细胞损伤及保护相关的技术路线图据此，设计一个关于细胞损伤与保护研究的具体方案，并绘制其他细胞损伤和保护的技术路线图。第四篇细胞与医学遗传综合实验第二章遗传病的诊断、分析与咨询实验病例一姓名：XX性别：出生日期：民族：地址：就诊日期：2008年5月主诉：2005年8月生育一男婴，出生时未觉异常，但吸吮能力较弱；三个月时发现其尚不能抬头，2岁时始能独立行走和说话，至今只能说简单词语，认知能力、辨别能力均较其他幼儿差。到当地卫生院就诊后认为该幼儿有严重的智力障碍，但未作进一步检查。目前李X已怀孕16周，急需知道所怀胎儿是否正常。一、诊断：（一）患儿的诊断：1.病史与家族史采集患儿唐X，2005年8月出生，病史见主诉；无家族史。2.症状与体征特殊面容（眼距宽，外眼角上斜，鼻部低平，张口伸舌、流），双手均为通关手；严重智障；隐睾。根据患儿的症状与体征，初步判断可能为Down综合征，须做染色体检查以确诊。3.染色体检查患儿外周静脉采血2ml，肝素抗凝，制备染色体标本，G显带染色后镜检并以染色体图像分析系统分析结果。（详见实验）检查结果：患儿核型为46，XY，+21诊断：Down综合征李X已生一胎Down综合征患儿，再次生育Down综合征的再发风险升高，建议做产前诊断。（二）李X的产前诊断1.病史两次妊娠史，已生育一Down综合征患儿，本次妊娠为第二次妊娠，目前孕16周，无明显早孕反应，孕前和怀孕后均无患病、服药和接触有害物质。在当地医院做产前检查均正常。2.Down综合征产前筛查Down综合征产前筛查（三联征产前筛查），检查时间为14-20周。检查血清中甲胎蛋白（MSAFP），血清绒毛膜促性腺激素（HCG），血清游离雌三醇（E3）检查结果：AFP15ng/mlHCG4.62ⅹ103IU/mlE317.7mol/L经计算机软件分析，Down综合征高风险的切割值（cutoff）1:20，筛查显示李X为Down综合征高风险产妇。三联征产前筛查显示了李X为高风险产妇，但三联征产前筛查存在5%的假阳性率，须做胎儿染色体检查确诊，目前孕周16周适宜做羊水染色体检查（16-20w）3.胎儿染色体检查B超监视下，用注射器经孕妇腹壁、子宫到羊膜腔抽取胎儿羊水20-30ml，将悬液均匀分配到无菌的培养瓶内，封口后置二氧化碳培养箱培养；每隔几天用倒置显微镜观察生长情况，根据需要更换部分培养基；培养15-20天，当细胞铺满瓶壁时，收获细胞进行染色体分析。检查结果：胎儿核型为46，XY，+21产前诊断：胎儿为Down综合征二、遗传咨询与治疗对李X的儿子和胎儿已作明确诊断，该疾病为染色体病（游离型），根据该病的性质、发病原理等特点，给与相应的遗传咨询（一）对策和措施1.告知与解释将诊断结果和产前诊断结果向李X解释，告知其该病的症状、原理、预后等情况，使其对Down综合征有充分的了解。2.建议和措施因胎儿确诊为Down综合征，建议李X采用人工流产。但应由患者及其亲属自行做出决定，咨询医师不应替他们做出决定。李X两次妊娠结果均为Down综合征，如再度妊娠，生育Down综合征的再发风险上升至1-2%（Down综合征的发病率为1/1000-2/1000）。建议如考虑再度怀孕的话，应再次作产前诊断。（二）Down综合征患儿治疗1.生活技能和社会适应力的训练Down综合征患儿可经过训练学会读和写，以及基本的生活技能。也可试用谷氨酸、叶酸、维生素B等，对促进小儿智力发育，提高智商可能有一定的作用。2.其它临床症状的治疗Down综合征患儿常伴有先天性心脏病（如房间隔缺损与房室畸形），急性白血病的发病率也比较高，可进行相关的检查，如伴有种类临床症状的，进行相关治疗。先天性心脏病的可采取手术治疗。（三）随访对咨询者进行随访，了解咨询的结果，特别是对李X是否选择人工流产、是否考虑再次受孕，进行随访，以便给与进一步的咨询。病例二姓名：XX性别：出生日期：民族：地址：就诊日期：2008年2月主诉：两年前起有视力减退，且病程发展迅速。到复旦大学附属眼耳鼻喉医院检查，诊断为视神经萎缩。患者有中心视力减退或丧失及视野缺损，但周围视力仍存在。视盘境界清楚，表面毛细血管减少或丧失，视盘颜色浅淡，视网膜血管狭窄。一、诊断（一）家系分析1.病史与家族史采集病史见主诉；询问家族史得知患者家族中共有8人罹患视神经萎缩。该病有明显家族聚集倾向，因此对患者家族作家系调查，分析其遗传方式。2.家系调查与系谱分析对患者的家族进行家系调查，并绘制成系谱（图4-2-1）。Ⅱ代中有两名患病，Ⅱ1女性，72岁，目前已失明。Ⅲ代中有5名患病，表现为不同程度的视力减退，均为Ⅱ1的子女。图4-2-1金XX系谱图根据该系谱的特点：①男女均有发病；②三代均有患者出现；③女性患者将疾病传递给后代，而男性患者不能将疾病遗传给后代；④女性不发病，但其后代患病。可见致病基因来自于女性，男性生殖细胞对表型无作用，该家系的遗传方式不符合孟德尔遗传规律，而是呈现母系遗传；考虑其为线粒体遗传病，先证者的母亲和外祖母未出现症状，符合线粒体遗传多质性、异质性、阈值效应的特点。根据系谱分析，此病为线粒体遗传的方式。可能为线粒体遗传病Leber遗传性视神经病（LHON），为确诊，对先证者和家族其他患者进行基因诊断。（二）基因诊断诱发LHON的mtDNA突变均为点突变。如：G11778A、G14459A、G3460A、T14484C、G15257A等，它们都位于呼吸链酶复合物Ⅰ（ND1,ND2,ND4和ND5）和呼吸链酶复合物Ⅲ（CytC）基因中。其中G11778A最为常见。1.PCR-RFLP法检测线粒体基因G11778A突变（1）抽取外周血，ACD抗凝。（2）抽提基因组DNA（详见第二篇）。（3）PCR扩增与限制性内切酶消化。设计mtDNA11778引物Primer1:5′-ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3′;Primer2:5′-CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3′PCR反应参数：94℃预变性300s，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，末轮72℃再延伸300s。扩增产物10μl加限制性内切酶SfaNI4U，37℃水浴消化12h。2%琼脂糖凝胶电泳检测，EagleEyeⅡ凝胶成像分析仪成像拍照。图4-2-2M:标准分子量Marker1:mtDNA11778PCR扩增条带2:对照组PCR产物酶切后条带3:无家族史患者酶切条带4～9:家系成员酶切条带mtDNA突变检测结果显示正常人mtDNA11778位点经PCR扩增后，可得到一条长924bp的扩增片段，经SfaNI酶切后可产生797bp+127bp两条片段。而LHON患者因mtDNAG11778A突变，丢失酶切位点而只能出现一条长924bp的片段（图4-2-2）。PCR-RFLP法检测证实患者有线粒体DNA11778位点的突变，可以确定是Leber视神经遗传病。也可以将DNA产物测序以进一步证实。3.DNA测序检测线粒体基因G11778A突变先证者和1例正常人的PCR产物进行序列测定，并进行序列同源性分析。（，人AY714050基因mtDNAND4基因组DNA）（图4-2-3）.图4-2-3DNA序列分析结果对LHON家系中的先证者和1例正常人的mtDNA11778PCR产物进行测序，证实先证者确实存在mtDNAG11778A突变。二、遗传咨询与治疗目前Leber视神经遗传病没有根治的方法，药物治疗和手术治疗只能为患者改善症状，但患者如已丧失视力，则没有良好的治疗措施。（一）治疗1.药物治疗药物中常用的包括神经营养药物如维生素B1、B12、ATP及辅酶A等，血管扩张药及活血化淤药类如菸酸、地巴唑、维生素E、维脑路通、复方丹参等。近年来通过高压氧、体外反搏穴位注射654-2等均已取得一定效果中药及针刺治疗已证明有一定疗效，可继续应用发掘整理。尚应提及的是，禁止吸烟及饮烈性酒，增强机体体。2.手术治疗血管分流术、网膜血管再植术治疗，可使供应视神经及视网膜的眼动脉、视网膜中央动脉和睫状后短动脉的血流量增加，改善了视神经及视网膜的缺血状态，丰富了视神经及视网膜的营养，使病人的视力得到了进一步的提高和视野的扩大。对患者及家族成员已作明确诊断，该疾病为染色体线粒体遗传病，根据该病的性质、发病原理等特点，给与相应的遗传咨询（二）遗传咨询1.告知与解释将诊断结果向患者家属解释，告知其该病的症状、原理、预后等情况，使其对本