复旦医学遗传学实验课件07遗传病分析4：人类淋巴细胞培养和染色体标本的制备

LOGO人类淋巴细胞培养和染色体标本的制备遗传病的分析4原理在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研究。因此利用人工的方法，使大部分分裂细胞处于中期而不向后期转化，并获得之，经处理，制片后观察分析。器材与试剂器材：人外周血5ml。培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。器材与试剂试剂：肝素含10%小牛血清RPMI1640植物血凝素（PHA）秋水仙素（5微克/毫升）0.075MKCl，固定液（甲醇/冰乙酸3:1）Giemsa染液。操作1、采血：取血3-5ml,肝素抗凝。2、接种：5ml培养液中加入0.3-0.5ml全血并摇匀，每份血样接种2瓶，置37℃,培养72h。3、秋水仙素处理：终止培养前1.5-2h加秋水仙素（终浓度为0.07ug/ml），混匀，37℃继续培养。4、收集细胞：将培养细胞混匀吸入刻度离心管（2瓶培养物吸入1支刻度离心管内），1500r/min离心，10min。5、低渗处理：弃上清，加8ml0.075MKCl溶液，混匀，置37℃水浴20min。操作6、预固定：低渗处理后，加1ml固定液混匀，5min后1500r/min离心，10min。7、固定：弃上清，加8ml固定液，混匀，室温静置30min，1500r/min离心，10min。8、再固定：同上（省略）。9、制备细胞悬液：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。10、制片：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。11、观察：Giemsa染色，5min，自来水冲洗，镜检。结果光镜100倍下人染色体G带照片注意事项培养温度应严格控制在37℃±0.5℃。培养液的pH值7.4±0.1，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞出现轻度固缩。PHA的质量和浓度很关键，它对淋巴细胞的刺激效应有个体差异较大。（肝素）秋水仙素一般最终浓度以0.04-0.08ug为宜，处理时间为1-4h。低渗的浓度与时间应掌握好。固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。LOGO