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细胞与遗传实验夏蓓莉/杨玲实验室要求•点名签到•穿白大衣•损坏公物要赔偿•保持实验室整洁干净、每次实验毕安排值日生细胞与遗传实验课程要求•每班根据实验需要分组，以组的形式完成细胞与遗传系统性实验•每次实验后，每人写实验报告1份（提交）•系统性实验结束后，每人写实验小结—细胞、遗传各1份（提交）•当逢课外加时，望能安排时间并请谅解•认真参与实验（思考、总结、提问和建议）实验（一）细胞损伤与保护1•活细胞观察•细胞传代培养•细胞计数细胞培养取活体动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体内环境（营养、温度、pH值、气体等），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、保持原来生物学特性的一种实验方法。实验目的通过对活细胞的培养1、掌握细胞培养的基本操作及技术要领。为进一步试验，打好基础。2、为后续实验，提供必需的试验材料。细胞培养内容•细胞原代培养•细胞换液、细胞传代培养•细胞形态观察、活率测定•细胞计数•细胞生长曲线、分裂指数•细胞冻存与复苏•等等实验室基本条件•无菌环境•仪器设备•普通器材•一般试剂无菌环境•无菌室•无菌操作无菌室结构图back无菌操作•洗手•着装•近火焰操作•试剂瓶等斜放back超静工作台二氧化碳培养箱液氮罐back器材back试剂back活细胞观察体外培养的、生长中的细胞，借助显微镜来进行察看、比较、判断，以求对细胞做出进一步处理。器材•倒置显微镜•培养细胞株方法•肉眼观察•显微镜下观察肉眼观察培养液清浊度培养液颜色显微镜下观察细胞的密度细胞的透明度细胞的形状光学显微镜（10倍）下活细胞形态光学显微镜（10倍）下活细胞形态光学显微镜（40倍）下活细胞形态光学显微镜（10倍）下活细胞形态back细胞传代培养细胞在支持物表面长满后，进行重新分配，再培养的过程。器材与试剂：•超净工作台•二氧化碳培养箱•倒置显微镜•细胞株（CHL）•滴管、培养瓶、瓶塞等•培养液：DMEM（含10%小牛血清）•消化液：0.25%胰蛋白酶液操作（无菌）细胞株——弃原培养液——加胰旦白酶液（消化细胞）——弃胰旦白酶液——定量加入培养液1ml，冲打细胞成悬液——取1滴细胞悬液细胞计数——按需接种至新培养瓶（皿）——补足新鲜培养液——37℃培养1-2min细胞传代消化法示意图显微镜下细胞消化前后示意图注意胰蛋白酶消化时间要严格掌握(温度、pH)back细胞计数细胞的传代、冻存、生化研究及生长曲线制作等，都需对细胞进行计数。细胞的多少对实验结果会有影响。器材•细胞株•血球计数板•普通光学显微镜试剂•0.25%胰蛋白酶液•培养液操作单层细胞——胰蛋白酶液消化细胞——定量（1ml）加入培养液——轻轻吹打细胞（单细胞悬液）——计数细胞计算公式细胞数/毫升＝（４大格细胞数÷4）×10000×稀释倍数1ml＝1000mm3细胞计数示意图注意•细胞悬液要充分打匀•正确使用计数板•悬液渗入计数室时，不易过多（溢出）、过少（气泡）•数细胞有压线时，数左不数右、数上不数下•正确使用显微镜（电源、亮度、倍数、聚光器等）小结活细胞观察（培养细胞瓶、皿或板放在倒置显微镜载物台上）——进入无菌室——细胞传代培养（1传2）——取1滴（或数滴）细胞悬液——显微镜下细胞计数告知实验（二）•细胞活率测定（MTT）•亚细胞结构分离及鉴定（离心）•细胞超微结构检测（电镜）告知一、9月16日-实验前2天中午饭后，细胞传代接种：小盖片培养瓶3瓶（1组），96孔板9孔（8组），25ml培养瓶8瓶（4组）二、9月17日-次日中午饭前，细胞换液（损伤）1、3瓶含小盖片培养瓶（电镜）2瓶正常、4瓶损伤2、每组96孔板9孔（活率）3孔正常、6孔损伤三、9月17日-下午课后5点，细胞换液（损伤恢复）4瓶损伤小盖片中2瓶、6孔损伤中3孔四、下午1:30继续实验