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分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素复旦大学化学教学实验中心张晋芬一、实验目的1、学习荧光分析法的基本原理及荧光的测定方法；2、掌握面粉的制样方法；3、了解荧光分光光度计的主要结构、工作原理及使用方法。二、内容提要某些物质经紫外光或可见光照射后，会发射出荧光（较入射波长更长），荧光光谱能反映这些物质的特性。根据荧光强度和波长的分析方法称为荧光分析法。对同一物质，在稀溶液（即A=abc0.05）中有：F=2.3ФfabcI0式中F荧光强度Фf荧光过程的量子效率；a荧光分子的吸光系数；b试样的吸收光程；c物质的浓度；I0入射光强度。当I0、b不变时：F=Kc荧光分析法灵敏度高（较分光光度法大2~3个数量级）、样少、快速等特点,在食品、医药、农业、环保、化工等领域广泛应用。但由于许多物质不会发生荧光，故在使用范围上受到一定的限制。维生素B2又称核黄素。冬春季寒冷干燥，有的人嘴唇会出现干裂，其主要原因是缺少维生素B2缺乏维生素B2会影响生物氧化，还会得舌炎、眼结膜炎、角膜炎等。动物内脏维生素B2含量高其次是奶、蛋、豆类等。小麦虽然是维生素B2的良好来源，但由于这些营养成分大部分集中在麦粒的外壳中，所以在面粉加工的过程中大部分损失掉了，精加工的面粉维生素与矿物质的损失更加严重。维生素B2每人每天摄入量不低于0.5mg.•维生素B2在430~440nm蓝光照射下发出荧光，峰值波长为525nm左右，在pH6~7的溶液中荧光最强，pH=11时荧光消失。•在稀溶液中，荧光的强度与维生素B2的浓度成正比，利用维生素B2的这一性质，选择合适的激发波长、荧光波长和实验条件，可对维生素B2进行定量测定。•本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。F-4500荧光分光光度计：主机、计算机工作站、GP-IB通信接口卡F-4500荧光分光光度计的工作原理——主机•光源（氙灯）•单色器：激发单色器发射单色器•样品池（低荧光材料）•检测器（光电倍增管、摸/数转换器、微处理器）•微处理器由GP-IB通信接口卡与计算机连接仪器功能：激发/发射波长扫描、荧光强度测定、时间扫描、三维荧光光谱扫描•工作原理：氙灯产生的连续光由激发单色器色散出具有一定光谱通带的单色光，照射在样品上激发后产生的荧光，由发射单色器色散成荧光光谱，并由光电倍增管检测荧光强度，通过模/数转换器转换为数字信号，经主机微处理器由GP-IB通信卡传送到计算机工作站。计算机工作站将接受到的数字信号进行处理，由显示器显示数据及谱图。三、实验步骤1、样品溶液的制备（两人制备一份）准确称取均匀的面粉样品7~8g；加入70~80ml0.1mol·L-1盐酸溶液(先加入几ml，搅拌成稀糊状，如有块状此时要用玻棒按压使颗粒分散后，再将剩余部分加入），加入150ml沸水，煮沸30min以上。冷却后在搅拌下用NaOH溶液调节pH值至6.0~6.5，再用HCl溶液调至4.5。将混合物定量转移至250ml容量瓶中，用1%醋酸溶液定容（因气泡，定容时可加1滴丁醇），先离心（注意使用离心机时保持平衡）再过滤（在砂芯漏斗中放一层滤纸），取20ml左右清晰滤液避光保存，待测。2、实验条件的选择（1）激发光波长（入射光波长）EX荧光波长（发射光波长）EM的选择①将荧光分光光度计的荧光波长（发射光波长）EM暂设定为525nm处，在400~500nm波长范围内对EX进行扫描，确定最佳的EX（最高峰值处）。②然后将激发光波长（入射光波长）EX设定在最高峰值处，在500~600nm波长范围内对EM进行扫描，确定最佳的EM（最高峰值处）。（2）酸度的选择分别用1：1盐酸、1%醋酸、5%氢氧化钠定容1.00ml核黄素标液于25ml容量瓶中，测定pH值并测定荧光强度，考察酸度对荧光强度的影响，确定最佳的调节pH的溶液。3、标准曲线的绘制（每人一份）准确移取50μg·mL-1核黄素标准溶液1.00ml，用（2）所确定的溶液定容于100ml容量瓶中。然后再依次移取此标准溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml于6个25ml容量瓶中，定容（用最佳溶液）。在所选定的实验条件下，从稀到浓测定各个标准溶液的荧光强度。（测定前，用空白液（0号样品）点击基线校正。）4、样品的测定四、注意事项1、面粉样品在加入大量液体前一定要分散开颗粒；2、为保证试液澄清，先离心再过滤，注意所用的器皿尽量空干水，必要时用溶液润洗；3、开机顺序：打印机电源—主机总电源(POWER)—氙灯电源（按下不超过一秒，黄灯应亮，打开后用支架保护）—主电源（MAIN）(绿灯频闪2-3下后熄灭)—显示器（CRT）—计算机关机顺序：终止程序——关计算机——关主电源（MAIN）——关主机总电源(POWER)——关计算机电源——关打印机电源4、设置参数时要注意输出方式（Output），只在做标准曲线时才选择打印(PrintReport)，其它实验条件的选择等都选择数据表显示（Excel）；5、测定面粉样品前，液槽需先用蒸馏水冲洗后再使用；6、维生素B2的水溶液遇光易变质，标准溶液应新鲜配制，制好的样品应避光保存。五、数据处理1、记录最佳激发光波长（入射光波长）EX和最佳荧光波长（发射光波长）EM；2、记录酸度对荧光强度的影响，确定测量的最佳pH值；3、打印标准曲线；4、记录面粉样品中核黄素浓度，并计算面粉样品中核黄素的含量。