复旦仪器分析实验课件12高效液相色谱法测定食品中的防腐剂和甜味剂

成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切高效液相色谱法测定食品中的防腐剂和甜味剂Highperformanceliquidchromatography复旦大学化学教学实验中心雷雷杰杰成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切内容提要内容提要••高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)的特点的特点••高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的主要类型和原理••高效液相色谱仪高效液相色谱仪••色谱柱简介色谱柱简介••色谱理论基础色谱理论基础••实验内容实验内容成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切历史回顾M.S.Tswett.Ber.Dtsch.Bot.Ges.24:384-393(1906)1906-MikhailSemenovichTswett(1872-1919)碳酸钙吸附剂石油醚1940‘s-分配色谱和纸色谱1950‘s-气相,薄层，凝胶过滤色谱1955年第一台商品GC仪器的推出1960‘s-商业高效液相色谱.一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)的特点的特点固定相、流动相；气相、液相。1950年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色谱学。提名为1917年诺贝尔化学奖的候选人成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切1952年，诺贝尔化学奖得主：A.J.P.马丁、R.L.M.辛格ArcherJohnPorterMartin（1910-2002）英国分析化学家RichardLaurenceMillingtonSynge（1914-1994）英国生物化学家获奖项目：发明分配色谱法。预言了GC的诞生。（1952年，发表了第一篇GC论文）成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论；在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压液相色谱的特点有：成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切1.高压：液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对流动相施加高压。2.高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。3.高效：颗粒极细（一般为10μm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高。4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5.适应范围宽：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切二、高效液相色谱法的主要类型和原理二、高效液相色谱法的主要类型和原理（一）主要类型¾分配色谱法（partitionchromatography）¾吸附色谱法（adsorptionchromatography）¾离子交换色谱法（IEC）¾空间排阻色谱法（SEC）¾化学键合相色谱法(bondedphasechromatography；BPC)¾亲合色谱法（affinitychromatography；AC）¾手性色谱法（chiralchromatography；CC）¾胶束色谱法（micellarchromatography；MC）¾电色谱法（electrochromatography；EC）成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法••以化学键合相为固定相的色谱法，简称以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法。键合相色谱法。••化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。优点：（1）固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；（2）柱效高；重现性好；（3）能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高根据化学键合相与流动相极性的相对强弱正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）键合相色谱法：通过特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面，现在多采用通过特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面，现在多采用的是化学键合固定相，如的是化学键合固定相，如C18C18、、C8C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。、氨基柱、氰基柱和苯基柱。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切（三）反相键合相色谱法（三）反相键合相色谱法••固定相：固定相：非极性键合相非极性键合相–如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶••流动相：流动相：水水为基础溶剂，加入一定量与为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂水混溶的极性调整剂–常用甲醇-水、乙腈-水体系等••应用：应用：广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切••保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素11、溶质的分子结构（极性）、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，容量因子极性越弱，疏水性越强，容量因子kk越大，保留时间越大，保留时间ttRR也越大也越大。。同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，kk越大；越大；引入极性取代基，降低疏水性，引入极性取代基，降低疏水性，kk值变小。值变小。22、固定相、固定相键合烷基的疏水性随键合烷基的疏水性随碳链的延长碳链的延长而增加，溶质的而增加，溶质的kk也增大。也增大。硅胶表面硅胶表面键合烷基的浓度越大键合烷基的浓度越大，则溶质的，则溶质的kk越大。越大。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切33、流动相、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的kk越大越大••溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂••溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使kk增大增大••中性盐的加入：使中性溶质的中性盐的加入：使中性溶质的kk增大增大••pHpH：：影响弱酸、弱减的离解影响弱酸、弱减的离解流动相的流动相的pHpH降低降低，，弱酸弱酸kk增大，增大，ttRR增大；弱碱相反。增大；弱碱相反。成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切AgilentAgilentHPLC1100HPLC1100五个主要部分五个主要部分::高压输液高压输液//溶剂传输系统溶剂传输系统样品进样样品进样//引入系统引入系统样品分离系统样品分离系统信号检测系统信号检测系统数据处理系统数据处理系统仪器配置仪器配置::在线脱气机、四元泵、多波长紫外检测在线脱气机、四元泵、多波长紫外检测器、柱温箱、手动进样器、器、柱温箱、手动进样器、2020μμLLHPLCHPLC进样环。进样环。三、三、高效液相色谱仪高效液相色谱仪成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenterforChemicaleducation,FDU化学教学实验中心而笃志学问而近思博切而笃志学问而近思博切AgilentHPLC1100AgilentHPLC1100堆积配置图堆积配置图成人与继续教育学院成人与继续教育学院职职业业教教育育学学院院ExperimentalCenterforChemicaleducation,FDUExperimentalCenter