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第十九章中药及其制剂分析概论样品预处理的原理与常用预处理方法样品预处理的目的：1.将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。2.除去杂质，纯化样品。3.富集浓缩或衍生化，便于含量较低成分测定。4.使试样的形式及所用溶剂符合分析测定要求。一、样品预处理的原则1.消除干扰因素2.尽可能完整保留待测组分，避免待测组分在预处理过程中丢失。3.防止样品在制备过程中被染，尽可能减少无关化合物引入。4.使被测组分浓缩5.便于成批处理试样，特别是自动化在线技术选择最佳预处理过程应考虑：1.被测组分的理化性质2.样品的化学组成3.干扰物质的类型4.样品组分处理过程中的稳定性5.样品在收集、储存和预处理过程中容器的污染6.适合分析仪器的样品最终使用的溶剂7.预处理过程尽量简单，有高的准确度和精密度8.预处理的最后一步应使被测组分富集二、常用预处理技术1.分离纯化技术：沉淀、结晶、回流提取、萃取、柱层析2.浓缩技术：冻干、红外干燥、旋转蒸发、气流吹蒸3.衍生化技术与标记技术：酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化、离子化4.消解技术：金属适于分析的状态经有机破坏和不经有机破坏2种方法如：氧瓶燃烧法、强酸破坏法取样一、抽样二、样品的粉碎粉碎的目的：保证所取样品均匀有代表性使样品中被测组分能被完全提取出来粉碎设备：粉碎机、各种食品料理机、铜冲、钵体、高速匀浆机或玻璃匀浆器等水蜜丸、水丸、糊丸、蜡丸、浓缩丸等可直接研细或粉碎大蜜丸:用小刀或剪刀将其切成小块，加硅藻土研磨分散。片剂:用小刀刮去糖衣层，置乳钵中研细即可。栓剂:可使用小刀将其切成小块。散剂、颗粒剂、硬胶囊剂:一般不需粉碎可直接提取。样品的提取一、提取方法1.冷浸法适用：热不稳定的样品易溶出样品，植物性粉末不适宜：动物性粉末方法：称取一定量样品置于带塞容器内，加入适量溶剂（样品量的10～50倍），称重，浸泡提取，浸泡时间12～24小时。浸泡后再称重，补足溶剂。测定：部分测定法（等量法）全部测定法（总量测定法）优点：操作简单，提取杂质少缺点：费时、费溶剂、不易提取完全按提取温度还可温浸、热浸。浸泡时间1-24小时；亲脂性←→亲水性石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水2.回流提取法适用：热稳定性的成分及较难溶出成分方法：以单一溶剂或混合溶剂于水浴/电热套加热回流提取优点：提取效率比冷浸法高，提取时间短，缺点：提取杂质较多不宜用于热不稳定或挥发性的成分每次提取时间为0.5-2小时，提取次数1-3次。通过更换溶剂，使提取更完全回流提取装置3.连续回流提取法（索氏提取）适用：热稳定性的成分方法：样品置索氏提取器中，用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取。样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管。优点：提取效率高，所需溶剂少提取杂质少，操作简便缺点：受热易分解的成分不宜使用4.超声提取法超声波振荡器（超声波清洗器）利用超声波的助溶作用进行提取原理超声波在液体中以疏密相间的形式向物体辐射，出现“空化”现象（气泡的形成、产生及破裂现象），形成超过1000个大气压的冲击力，可把物体打成极细小微粒，起到助溶作用适用：热稳定性的成分方法：样品置适当容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器中提取。优点：提取效率高，提取速度快，操作简便注意：超声频率、提取时间、温度需考察5.超临界流体萃取法（SFE）超临界流体当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态是一种处于超临界点之上的流体，是介于气体与液体之间的一种物相兼有气体与液体的一些特性气体超临界流体固体T↓压力↑T↑压力↓SFE工艺流程超临界流体萃取与化学法萃取相比有以下突出的优点：（1）它具有与液体相似的密度，因而具有与液体相似的较强的溶解能力；（2）溶质在流体中的扩散系数与气体相似，具有传质快，提取时间短的优点；（3）超临界流体的表面张力为零，易渗透到样品中，带走测定组分；（4）超临界流体在通常状态下为气体，萃取后溶剂可立即变成气体而逸出，易达到浓集的目的；（5）CO2是一种不活泼的气体,萃取过程不发生化学反应,且属于不燃性气体,无味、无臭、无毒，故安全性好；（6）CO2价格便宜，纯度高，容易取得，且在生产过程中循环使用，从而降低成本；（7）该技术易与其他仪器联用实现自动化影响因素：温度、压力、改性剂和提取时间。恒温下，提高压力，超临界流体的溶解性参数将增加，有利于极性组分和高分子量组分的提取；在较低压力下，溶解性参数较小，则有利于非极性组分的提取，在提取极性组分时，可加入适量有机溶剂作为改性剂，如甲醇、氯仿等。适用：主要用于热不稳定成分或挥发性成分，也可热稳定性成分主要用于非极性、弱极性化合物，也可极性化合物：加入极性改性剂（甲醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。方法：超临界流体萃取仪优点：萃取效率高、速度快、准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，并能与色谱和光谱等仪器联用。6.水蒸气蒸馏法蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。最常用：水蒸气蒸馏法适用于：具挥发性的可随水蒸气蒸出的组分的测定适用：挥发油，小分子生物碱（麻黄碱、槟榔碱）丹皮酚优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来用GC测定挥发性组分时用挥发油提取器7.萃取法萃取法：利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使物质从一种溶剂转移到另一种溶剂中，将测定组分提取出来的方法。（1）萃取溶剂的选择正丁醇——用于皂苷类；醋酸乙酯——用于黄酮类；氯仿——用于生物碱类；乙醚、石油醚——用于挥发油。（2）水相pH的选择酸性成分——比其pKa低1-2个pH单位;碱性成分——比其pKa高1-2个pH单位.（3）仪器和提取次数（4）酒剂和酊剂——先挥去乙醇（5）防止和消除乳化分液漏斗鉴别——1次含量测定——3~4次（6）盐析作用：水相用NaCl饱和，提高提取率。7.加压溶剂萃取法（PLE）全新的处理固体和半固体样品的方法方法：将样品放在密封容器中，加热到高于溶剂沸点的温度，引起容器中压力升高，同时给予一定压力，使溶剂不气化，从而大大提高萃取速度PLE实现了高温高压条件下的萃取美国环境保护署推荐的标准方法8.微波辅助萃取法（MAE）将样品置于不吸收微薄的容器中，用微波加热，进行萃取。优点：1.萃取时间短2.溶剂用量少3.可根据吸收微波能力的大小选择不同的萃取溶剂，控制样品与溶剂间的热交换。4.多个样品可同时萃取9.消化法目的：重金属及砷盐检查限量较低，有机成分往往会严重干扰测定，须采用合适的方法破坏这些有机物常用的破坏方法：湿法消化，干法消化湿法消化1.硝酸—高氯酸法适用于血，尿、组织等生物样品和动植物药制剂的破坏有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏2.硝酸—硫酸法适用于大多数有机物质的破坏破坏得到的无机金属离子均为高价态不能用于含碱土金属有机药物的破坏不适用于与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子3.硫酸—硫酸盐法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态（三价砷或锑）。样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。其它湿法硝酸—硫酸—高氯酸法硫酸—氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）破坏后，金属呈高价态注意点：所用仪器一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶所用试剂应为优级纯水应为去离子水或高纯水按相同条件进行空白试验校正操作在通风橱内进行干法消化将有机物灼烧灰化达到分解目的方法：将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO以助灰化。混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。适用：1.湿法不易破坏完全的有机物；2.某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用：含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420℃以下，防止金属化合物的挥发（2）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去二、分析目的与样品提取1.供鉴别用样品提取2.供杂质检查用样品提取3.供含量测定用样品提取样品的净化1.沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法2.液-液萃取法：1）直接萃取法2）离子对萃取法离子对萃取法常用于生物碱的分析有机相·(BH+In-)水相·(BH+In-)+HInH+In-+BH+BH+基本原理：在适当的PH介质中适用：高度离解的有机酸、有机碱中药制剂分析主要用于生物碱（B）离子对试剂：常为酸性染料（In-）如：溴百里酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）注意：水相pH值的控制离子对试剂的选择。3.经典柱色谱法最常用：经典柱色谱方法：将样品溶液加到装有合适固定相的色谱柱中（1）保留测定组分在柱上，洗去杂质，再用适当溶剂洗下组分（2）保留杂质于柱上，直接洗脱被测成分进行测定常用固定相氧化铝大孔吸附树脂聚酰胺LSE常用填料⒈硅胶、氧化铝等：传统吸附剂，极性吸附剂氧化铝：用于生物碱、苷类等碱性、中性成分的测定，吸附酸性成分硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。⒉键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（C18，ODS），C8——分离脂溶性杂质或成分氨基、氰基键合相硅胶——分离水溶性杂质或成分⒊大孔树脂：分为极性和非极性型，D101最常用注意：预处理；定量时回收率⒋聚酰胺：氢键吸附——常用于含ph－OH的黄酮类成分⒌硅藻土、纤维素：亲水型填料，分配作用流动相：与水不混溶的有机溶剂洗脱：亲脂性的成分⒍离子交换树脂：萃取样品液中可离解化合物除去样品中的离子，防止组分分解四、固相萃取法五、固相微萃取技术样品的浓缩与衍生化一、样品提取液的浓缩1.水浴蒸发：蒸发皿2.自然挥散3.减压蒸发：旋转蒸发仪4.气流吹蒸:氮吹仪5.冷冻干燥：高真空二、样品的衍生化1.GC中的衍生化：目的：1）提高成分挥发性2）增加成分的稳定性3）生成非对应异构体主要衍生化反应：1.硅烷化2.酰化3.烷基化4.不对称衍生化2.HPLC中的衍生化目的：1）提高检测灵敏度2）改善色谱分离效果分类：1）柱前1）在线2）柱后2）离线方法：1）紫外衍生化反应2）荧光衍生化反应3）非对映衍生化反应不同剂型中药制剂供试品制备特点一、固体制剂的预处理特点1.片剂片剂中常含有一定量的赋形剂，如淀粉、糊精、糖粉、硫酸钙等，有的还含有药材细粉，某些成分仍保留在植物组织、细胞中。样品的提取：将片剂研碎（糖衣片需除去糖衣）后，过一定目筛，选择适宜的溶剂。（超声、冷浸、回流、连续回流）样品的净化：液-液萃取法；柱色谱法2.丸剂样品的提取：超声、冷浸、回流、连续回流样品的净化：溶剂提取法；沉淀法；柱色谱法3.颗粒剂经过提取相对较纯净：若颗粒剂全部为药材提取物，可用合适的溶剂进行溶解或提取。含药材细粉的颗粒剂，要注意提取溶剂的渗出透性：超声提取法、回流提取法避免糖、糊精等辅料对测定的干扰。提取液的精制：液-液萃取法、柱色谱法。4.胶囊剂硬胶囊：将药物全部倾出，参考颗粒剂或散剂的特点提取分离软胶囊：剪破囊材，挤出内容物，若内容物黏附在囊壳内壁，可用提取溶剂洗涤囊壳，洗涤液与样品一同处理。肠溶胶囊5.散剂重点应注意对剧毒成分和贵重药材进行分析分析取样时应注意样品的代表性。药材粉末中具有形态特征的组织碎片是显微鉴别的重要依据，可用于判断制剂的真伪。常用的提取溶剂：水、乙醇、甲醇、乙醚、氯仿常见的提取方法：冷浸法、加热回流法、连续回流法、超声提取法6.栓剂应注意减少基质的干扰：将栓剂与硅藻土等惰性材料混合、研匀，转入回流提取器中，用适宜的溶剂回流提取，具体如下：亲水性基质：用有机溶剂提取。油脂性基质：水或稀醇提取；将栓剂切成小块，加适量水，于温水浴上加热使其融化，搅拌一定时间