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1课程名称：《药物分析》第6周，第12讲次摘要授课题目（章、节）第五章体内药物分析第一节常用体内样品的制备与贮藏第二节体内样品分析的前处理第三节体内样品分析方法与方法验证【目的要求】通过本讲课程的学习，掌握体内药物分析的特点和应用，体内样品分析的前处理，体内样品分析方法验证的内容，体内样品的采集与制备方法，熟悉体内样品分析方法验证的技术要求，体内药物分析的性质与意义。【重点】体内样品分析的前处理，体内样品分析方法验证的内容，体内样品的采集与制备方法。【难点】体内样品分析的前处理，体内样品分析方法验证的内容，体内样品的采集与制备方法。内容【本讲课程的引入】体内药物分析是指体内样品中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析它直接关系到药物体内作用机制的探讨与质量评价和药物临床使用的安全有效与合理。板书“体内药物分析”。板书设计：写出章节的题目，参照讲稿列出标题；根据需要在每个标题下适当写出需解释的内容或强调重点、难点等。【本讲课程的内容】概述1.体内样品的特点(1)采样量少:ml~µl级;且不易重新获得(2)待测物浓度低:µg/ml~ng/ml级,甚至pg/ml(3)干扰物质多:尤其是血样和组织中的蛋白质2.体内药物分析的特点(1)样品需经纯化浓集,或化学衍生化处理(2)对分析方法的灵敏度及专属性要求较高(3)分析工作量大,数据处理和结果阐明繁杂第一节常用样品的制备与贮藏1．血样最常采用的血样为全血、血浆和血清，其中选用最多的是血浆。因为当药物进入体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，可以反映药物在体内靶器官的状况，能真正代表体循环中的血药浓度，才能供作计算有关药物动力学参数之用。血浆的取得是在加肝素、构椽酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，其量2约为全血量的一半。实际工作中制备血浆时最常用的抗凝剂为肝素，它是一种含硫酸盐的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.1—0.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。血清则是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的30％一50％。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37℃温度下加速血清析出。全血也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据。由于全血的净化较血浆和血清麻烦，特别是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行测定。如不能立即测定时，应妥善贮存。短期保存时置冰箱（4℃），长期保存时要在冷冻（-20℃）。(二)唾液唾液是由腮腺、领下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌的，在口腔内并合成混合唾液。唾液的pH约为6.9±0.5，日分泌量约为1～1.5L，个体差异较大，同一个人日内与日间也有变动，各腺体分泌的唾液组成也会有相当差别。此外还受有无刺激，刺激类型、强度、持续时间、年龄、性别、疾病与药物等因素的影响。唾液的采样一般是在漱口后15分钟，收集口内自然流出或舌在口腔内搅动后流出的混合唾液，然后用2000～3000r／min离心15分钟，小心吸取上清液，然后作进一步分离、净化处理后即可供测定用。(三)尿祥尿药测定主要用于药物剂量回收，药物肾清除率、药物体内代谢及生物利用度研究，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢快、慢型测定等。体内药物消除主要是通过尿液，以药物原形或代谢物及其缀合物形式排出体外。因尿药浓度较高，通常变化较九所以应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就需要测定在规定时间内的尿液体积及尿药浓度。尿液主要成分是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即3测定。实际工作中若需收集24小时或更长时间的尿样，而不能立即测定时，则应置于4℃冰箱内冷藏。如需在室温保存，则应在采样后的尿液立即加入少量防腐剂甲苯或氯仿。体内样品的贮存与处理(一)冷藏与冷冻短期保存:冰箱(4℃)冷藏长期保存:冷柜(-20℃/-70~-80℃)冷冻,小体积分装1.血浆/血清:分离(≯2h),硬质玻璃/聚乙烯管(EP),冷冻2.尿样:冷藏(24~36h)加防腐剂3.唾液:冷冻保存时,解冻后充分搅匀后再用(二)去活性采样后立即终止酶的活性常用方法:液氮速冻,微波照射,匀浆/沉淀,加酶活性阻断剂(氟化钠)或抗氧剂(VC),煮沸第二节体内样品分析前的处理1．去除蛋白质目前有很多除去蛋白质的方法，下面重点介绍几种常用的方法。（1）加入可与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物释放如乙腈,甲醇,丙酮,四氢呋喃等血浆/血清与有机溶剂的体积比1∶(2-3)（2）加中性盐饱和硫酸铵,硫酸钠,硫酸镁,氯化钠等，血清与饱和硫酸铵溶液的比1∶2（3）加入强酸10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液，血清与强酸的比1∶0.6（4）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂（5）酶解法（6）热凝固法热变性蛋白质沉淀，通常90℃，方法简单，只能除去热变性蛋白需待测物热稳定性好。2．缀合物的水解3．分离、纯化与浓集4（1）液-液提取法1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；②沸点低,易挥发;③与水不相混溶;④无毒,不易燃烧;⑤具有化学稳定和惰性;⑥不影响紫外检测（2）液-固提取法含药物体内样品通过小柱时,受到“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)洗脱方式有两种:①冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;②药物直接被洗脱,干扰物保留（3）被测组分的浓集4．化学衍生化（1）GC法中化学衍生化法在GC中的应用1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)2)酰化:三氟乙酸酐(TFAA)3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)4)不对称衍生化:(S)-N-三氟乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)（2）HPLC法中化学衍生化法1)衍生化的分类柱前/柱后;在线/离线2)衍生化方法(1)紫外衍生化(2)荧光衍生化(3)非对映体衍生化第三节定量分析方法的验证首先为分析方法的验证——特异性、精密度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证——室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环验证的效能指标1．特异性特异性(specificity),又称专属性或专一性,5通常与选择性(selectivity)互用2．标准曲线与线性范围少数方法(如,IA)外,通常为线性模式线性回归:最小二乘法或加权最小二乘法自变量(x)为药物浓度,因变量(y)为响应信号强度标准曲线建立（1)系列标准溶液:n≥6(不包括0点);等比系列(2~3);通常为100~1000倍(2)内标溶液:浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度(3)系列标准样品:空白生物介质,加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制:药物浓度,以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示。限度要求：通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点定量范围覆盖全部待测样品浓度范围定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)标准曲线各浓度点的回归计算值(x’)与标示值(x)之间的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范围之内最低浓度点的偏差在±20%以内其余浓度点的偏差在±15%以内3．精密度与准确度方法精密度除评价批内(日内)RSD外,同时还应评价批间(日间)RSD高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:几何平均浓度同法独立测定3天准确度:低,80%~120%;中高,85%~115%RSD:低,20%;中高,15%4最低定量限6定量下限(LLOQ):标准曲线上的最低浓度点符合准确度和精密度要求室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h)冷藏(4℃)数个工作日(标准储备液至整个分析完成)冷冻(-20℃/-80℃)至整个分析完成冻-融至少经历3个循环5样品稳定性短期稳定性:在1个分析批内,样品室温等待处理;处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性长期稳定性:在整个样品分析期间,体内样品的长期储藏,冻融;以及标准储备液的稳定性6提取回收率高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂)同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质)7质控样品(qualitycontrolsample):即QC样品,在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品8质量控制每个未知样品测定一次,必要时进行复测来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定每个分析批,建立批标准曲线;并随行3浓度QC样品QC样品每个浓度至少双样本,并均匀分布在未知样品顺序(低→高/高→低顺序均匀穿插整个分析批)中一个分析批内未知样品数目较多时,应同时增加各浓度QC样品数,使QC样品数大于未知样品总数的5%QC样品测定结果的偏差不大于±15%,低浓度点偏差不大于±20%;允许1/3非同浓度QC样品结果超限不符合上述要求,则该分析批样品测试结果作废7【本讲课程的小结】今天我们主要讲了体内药物分析的特点，体内样品的制备贮藏和分离纯化方法，希望同学们认真学习。【本讲课程的作业】1．常用体内样品有哪些？2．去除蛋白质的方法有哪些？3．简述固相萃取的原理和洗脱方式。