华北理工药物分析教案第16章 抗生素类药物的分析

1课程名称：《药物分析》第14周，第25讲次摘要授课题目（章、节）第十六章抗生素类药物的分析第一节概述第二节β-内酰胺类分析第三节氨基糖苷类分析第四节四环素类分析【目的要求】通过本讲课程的学习，掌握抗生素类药物的类型、结构、质量和稳定性特点、以及分析方法。熟悉各类抗生素药物的有关物质来源、特点和检查方法。了解：抗生素药物的体内样品分析方法和临床监测应用。【重点】抗生素类药物的鉴别原理与方法。含量测定的原理、测定方法。【难点】抗生素类药物的鉴别原理与方法。含量测定的原理、测定方法。内容【本讲课程的引入】抗生素antibiotics是临床常用的一类重要药物。本章围绕抗生素类药的化学结构理化性质和分析方法之间的关系，结合中国药典，重点讲解本类药物的鉴别、检查和含量测定的原理和方法。板书“抗生素类药物的分析”。【本讲课程的内容】第一节概述抗生素(Antibiotics)类药物是临床上常用的一类重要药物，临床使用的抗生素的主要是生物合成，经过发酵和提纯两步制得；也有少数是利用化学合成或半合成方法制得。ChP2010共收载抗生素类原料药及其各种制剂近300个品种。一、抗生素类药物的定义和特点青霉素于1929年被Flemmimg发现，至1943年链霉素的发现者赛尔曼•瓦克斯曼才给出了抗生素的定义，即微生物代谢产生的能抑制它种微生物生长活动甚至杀灭它种微生物的化学物质。一般认为，比较确切的抗生素的定义应为：抗生素是生物(包括微生物、植物、动物)在其生命活动中产生的(或并用化学、生物或生化方法衍生的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。与化学合成药物相比，其结构、组成更复杂，表现为：1.化学纯度较低有三多：即同系物多，如庆大霉素、新霉素、等含有多个组分；异构体多，半合成-内酰胺抗生素、氨基糖苷类抗生素具有旋光性，均存在光学异构体，如药用巴龙霉素为两个立体异构体巴龙霉素I和巴龙霉素II的混合物；降解物多，如四环素类存在脱水、差向异构体。2.活性组分易发生变异微生物菌株的变化、发酵条件改变等均可导致产品2质量发生变化，如组分的组成或比例的改变。3.稳定性差抗生素分子结构中通常含有活泼基团，而这些基团往往是抗生素的活性中心，如青霉素、头孢菌素类结构中的-内酰胺环，链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点。二、根据抗生素的化学结构分类1．β-内酰胺类：青霉素：青霉素钾（钠）、阿莫西林、氨苄西林等头孢菌素类：头孢他啶、头孢拉啶等2．氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、萘替米星等3．四环素类：四环素、金霉素、土霉素等4．大环内脂类：红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等5．多烯大环类：制霉菌素、两性霉素B等6．多肽类：多黏菌素、放线菌素等7．苯烃胺类：氯霉素等。8.蒽环类：阿霉素、紫红霉素等9．其他抗生素（凡不属于上述类型的抗生素）均归于其他类。三、抗生素类药物的细菌耐药性在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的微生物，统称耐药菌。所谓细菌耐药性(bacterialresistance)又称抗药性，是指细菌产生的对抗菌药不敏感的现象，是细菌自身生存过程的一种特殊表现形式。1.耐药性的种类2.耐药的机制四、抗生素药物的质量分析抗生素类药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量(效价)测定三个主要方面来判断其质量的优劣。由于抗生素类药物的特点，其分析方法可分为理化方法和生物学法两大类。(一)鉴别试验抗生素类药物的鉴别试验主要为理化方法，常用方法有：1.官能团的显色反应如-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应。对于抗生素盐类，通常鉴别酸根或金属离子或有机碱。32.光谱法包括红外光谱与紫外吸收光谱的鉴别。抗生素的红外光谱分析时需注意，由于抗生素存在多晶现象，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照品，使处于相同晶型情况下再进行测定，若多晶效应是由于研磨和压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法试验。3.色谱法包括TLC和HPLC法，采用对照品或标准品对照法。4.生物学法是检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别，此法已很少应用。(二)检查抗生素类药物的检查项目包括：1.影响产品稳定性的检查项目结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等；2.控制有机和无机杂质的检查项目溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；3.与临床安全性密切相关的检查项目异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等；4.其他检查项目对于多组分抗生素还要进行组分分析等(如硫酸庆大霉素的“庆大霉素C组分的测定”)。此外，有些抗生素还规定“悬浮时间与抽针试验”(如注射用普鲁卡因青霉素)、“聚合物”(如-内酰胺类抗生素)、“杂质吸光度”(如四环素类抗生素)等。(三)含量或效价测定1.微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性(效价)的方法。测定方法可分为管碟法和浊度法2.理化方法是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性。第二节β-内酰胺类一、结构特点与分析方法之间的关系4NSCH3CH3COOHRCO-HN-oNSCOOHCH2R1ORCO--HN青霉素头孢菌素1.β-内酰胺环：易降解，可利用降解产物进行鉴别和含量测定。芳环侧链：具有紫外吸收，可进行鉴别和含量测定。本类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类，它们的分子结构中均含有β-内酰胺环，因此统称为β-内酰胺类抗生素。2．性质(1)β-内酰胺环的不稳定性：β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。干燥条件下青霉素和头孢菌素类药物均较稳定，室温条件下密封保存可贮存3年以上，但他们的水溶液很不稳定，随pH和温度而有很大变化。青霉素水溶液在pH6～6.8时较稳定。本类药物在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子(铜、铅、汞和银)或氧化剂等作用下，易发生水解和分子重排，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。(2)旋光性：青霉素类分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素类含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。根据此性质，可用于定性和定量分析。(3)酸性与溶解度：青霉素类和头孢菌素类分子中的游离羧基具有相当强的酸性，大多数青霉素类化合物的pKa在2.5～2.8之间，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离基的白色沉淀。(4)紫外吸收特性：青霉素类分子中的母核部分无共轭系统，但其侧链酰胺基上R取代基若有苯环等共轭系统，则有紫外吸收特征。如青霉素钾(钠)的R为苄基，因而其水溶液在264nm波长处具有较强的紫外吸收。而头孢菌素类母核部分具有O＝C－N－C＝C结构，R取代基具有苯环等共轭系统，有紫外吸收。二、鉴别试验本类药物的鉴别试验，现版ChP，USP，BP采用的方法主要为HPLC、IR和TLC法。(一)色谱法利用比较供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间(tR)是否一致或比较供试品溶液与对照品溶液所显主斑点的位置和颜色是否相同进行鉴别。HPLC法一般都规定在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰应与对5照品溶液主峰的保留时间一致。中国药典对鉴别试验中有HPLC法又有TLC法的，规定可在两种鉴别方法中选做一种。(二)光谱法1.红外吸收光谱(IR)红外吸收光谱反映了分子的结构特征，各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素的β-内酰胺环羰基的伸缩振动(1750cm-1～1800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1，1525cm-1，1680cm-1)、羧酸离子的伸缩振动(1600cm-1，1410cm-1)是该类抗生素共有的特征峰。2.紫外吸收光谱(UV)本类药物的紫外光谱鉴别法通常利用最大吸收波长鉴定法：将供试品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸光度进行鉴定。如头孢唑啉钠的紫外鉴别法：取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含16g的溶液，在272nm的波长处有最大吸收。(三)呈色反应1.羟肟酸铁反应青霉素与头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。2.类似肽键的反应本类药物具有-CONH-结构，一些取代基有-氨基酸结构，可显双缩脲和茚三酮反应。3.其他呈色反应侧链含有-C6H5-OH基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色。此外，本类药物还可与变色酸-硫酸、硫酸-甲醛等试剂反应而呈色。(四)各种盐的反应钾、钠离子的火焰反应三、检查本类抗生素的杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸光度来控制杂质量的。此外，有的还进行结晶性、抽针与悬浮时间等有效性试验，部分抗生素还检查有机溶剂残留量。(一)聚合物(二)有关物质和异构体(三)吸光度(四)有机溶剂(五)结晶性四、含量测定各国药典收载的青霉素类和头孢菌素类的含量测定除少数几个样品采用抗生6素微生物检定法测定外，大多采用HPLC测定方法。高效液相色谱法是近年来发展最快的方法，它能有效地分离供试品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质，并能准确定量，适用于本类药物的原料、各种制剂及生物样本的分析测定。ChP2010收载的本类抗生素中除磺苄西林钠采用微生物检定法测定含量外，其余均采用HPLC法测定含量。第三节氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素抗生素的化学结构都是以碱性环己多元醇为苷元，与氨基糖缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素(AminoglycosidesAntibiotics)。主要有硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、盐酸大观霉素、硫酸小诺霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。OOHOOHHN--C---NH2H2N--C---NHNH*OHCH3CHOOHOOCH2OHOHOH*NH*NHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺OOOOHOCH2OHHONH2HOOOHNH2NH2OHOOHR2NH2CH2OH****R1D-葡萄糖胺脱氧链霉胺D核糖巴龙霉糖OONH2OHOOOHNHCH3OHCH3NH2NH2R1HN---C----R3***R2*绛红糖胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺链霉素：由链霉胍、链霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺结合而成。庆大霉素：绛红糖胺、2-脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成。7性质氨基糖苷类抗生素的分子结构具有一些共同或相似处。1.庆大霉素、巴龙霉素、奈替米星等分子中氨基环醇(脱氧链霉胺)结构与链霉素中链霉胍相近；2.D-核糖与链霉糖相似；胺基己糖(D-葡萄糖胺)结构与链霉素中N-甲基葡萄糖胺相似，因此，他们具有相似的性质。1.溶解度与碱性该类抗生素的分子中含有多个羟基(故也称多羟基抗生素)和碱性基团(分子式中有*号处)，同属碱性、水溶性抗生素，能与矿酸或有机酸成盐，临床上应用的主要为硫酸盐。他们的硫酸盐易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有机溶剂。2.旋光性本类抗生素分子结构中含有多个氨基糖，具有旋光性。如ChP2010二部中硫酸奈替米星的比旋度为+88～+96(水溶液)；硫酸庆大霉素的比旋度为+107～+121(水溶液)；硫酸巴龙霉素的比旋度为+50～+55(水溶液)。3.苷的水解与稳定性含有二糖胺结构的抗生素(如链霉素、巴龙霉素、新霉素)，分子中氨基葡萄糖与链霉糖或D-核糖之间的苷键较强，而链霉胍与链霉双糖胺(苷元与二糖胺)间的苷键结合较弱。一般的化学反应只能将他们分解为一分子苷元和一分子双糖。链霉素的硫酸盐水溶液，一般以pH5~7.5最为稳定，过酸或过碱条件下易水解失效。在酸性条件下，链霉