华北理工水处理生物学课件06细菌的生长和遗传变异1

第三章细菌的生长和遗传变异主要内容3-1细菌的生长及特性3-2细菌的遗传与变异一、生长与繁殖的概念二、细菌生长的测定方法三、细菌的生长特性四、微生物膜的生长特性3-1-1生长与繁殖同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。生长一定程度后细胞分裂，这就是繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。群体生长＝个体生长＋个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才有意义，因此“生长”一般指群体生长。3-1-2细菌的生长测定方法计数法直接计数法——借助显微镜间接计数法——平板计数生长量测定法测定重量、体积、含氮量来反映细菌的生长（一）计数法1、直接计数法（显微镜）①涂片染色法：一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。②滤膜染色法：一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。③比例计数法——将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。①涂片染色法1视野菌液(ml)＝(0.1ml／1cm2)*视野面积(cm2)0.1ml菌液均匀涂布，染色面积1cm2计数每个视野细菌的平均数量细菌数量=视野中的菌液体积=××个/mL目镜中的视野每个视野的面积由目测微尺的单元格量出，视野中菌液的体积按比例折算计数器(血球计数板）测定法计数格=4×4=16大格血球计数板1大格=5×5=25小格1小格=0.05mm×0.05mm=0.0025mm2总体积=16×25×0.0025×0.1=0.1mm3=1×10-4mL每小格长宽1×1mm每小格深0.1mm盖玻片计数板菌液滴染色（或不染色）面积1cm2血球计数板1×10-4ml菌液数了80个小格中有120个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(120个÷80)×400/1×10-4ml=600×104个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数16×5=80个小格），折算样品细菌浓度；②滤膜染色法一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。需要知道滤液的体积和滤膜的面积。在显微镜下计数，方法相同。③比例计数法比例——样品菌液与等体积（或成一定比例）的血液混合，观测二者比例样品溶液与等体积的血液混合涂片如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5×400万个/ml=2.2×107个/mL样品红血球数已知(男性400~500万个／mL，女性350~450万个／mL)，平均400万个/mL细菌红血球比例计数法——将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（特点：不要求记体积）DAPI:4'6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride4,6-二脒基-2苯基吲哚DNA2Cl-H2N+NH2CNHH2N-CNH2Measurementoftotalcellcounts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAFDAPI:无毒性荧光染料，能够与DAN双链强力结合并产生荧光。采用358nm紫外光照射能发射明亮的蓝色荧光。5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluoresceinDNAOOHOOHOOHNHNNClNClMeasurementoftotalcellcounts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF有必要区分细菌的死活吗？饮用水中卫生细菌学标准是TBC100个/mL（平板计数的标准），如果我们采用染色显微镜检测技术对刚刚加氯消毒的饮用水进行检测，可能会发现细菌数量会远远超过100个/mL，是不是饮用水就是不合格的饮用水呢？美蓝染色法（酵母活细胞计数）活细胞：无色死细胞：蓝色活菌直接计数（DVC，DirectViableCounts）•吖啶橙（AO）染色直接计数•BacLight染色直接计数法•N.A.法•CTC染色直接计数吖啶橙（AO）染色直接计数（AODC）吖啶橙染色直接计数法（AODC）：水样采集后迅速加入甲醛固定，甲醛最终浓度2%；取10mL固定后水样加入0.5mL0.2%吖啶橙（AcridineOrange，Sigma公司）染色1~2min.；将染色水样经滤膜（孔径0.2µm，直径25mm，黑色聚碳酸脂滤膜，Nuclepore公司）过滤；过滤后将滤膜置于载玻片上，用落射荧光显微镜（日本Nikon，EF-D型）计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体；显微镜光源为200W汞灯，激发光滤光片为450~490nm，光束分离滤光片510nm，阻挡滤光片520nm。吖啶橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光活细胞：橙色荧光死细胞：绿色荧光AODCBacLight染色直接计数法(一种核酸探针)BacLight染色直接计数法：将试剂按照产品要求配制后，取2mL固定后水样加入60µL所配BacLight染色试剂，避光培养15~20分钟；然后按照AODC处理方法制片，观察计数视野中发红色或绿色荧光的菌体。所用滤光片波段同AODC相同。镜检计数视野中发绿色荧光的菌体为活菌。BacLightN.A.法向水样中加入0.002%萘啶酮酸（NA，NalidixicAcid，Fluka公司）和0.025%酵母膏（均为最终浓度），避光，25℃培养6h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数。视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌。N.A.CTC染色直接计数——活菌计数将0.2mL1.67%的CTC加入10mL水样中（CTC最终浓度1mM），避光室温培养4h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数视野中的红色菌体。CTC双重染色10µmDTAF和CTC双重染色法rRNA核糖体核酸Oligonucleotideprobe核酸探针FluorescenceFISH（荧光原位杂交法）FluorescenceInsituhybridization16sRNA的碱基组成—设计特异的探针（probe）FISH法的步骤rRNA萤光标示探针(Probe)渗透Hybridization萤光显微镜观察、计数細胞10µmFISH法DTAF染色土壤中微生物的测定细菌同视野2、间接计数法——一种活菌计数法①平板计数法：描述：CFU（colonyformationunit）/mL将一定体积的菌液，均匀涂布在固体培养基上（例如水中细菌总数采用的营养琼脂培养基），一定温度下培养，计数平板形成的菌落，一个菌落代表一个细菌。计数活细菌，死细菌不能够生长注意：一般可培养的微生物很少，计数结果与采用显微镜直接计数的结果差几百倍，甚至千、万。稀释平板计数法—固体培养法菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图无菌水稀释平板计数法—固体培养法第一步：菌样巧妙稀释1mL混合1mL混合9mL10mL1：10-110-1：10-210-210-310-410-5得到不同稀释度（10-x）菌液10-210-310-410-5各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落•一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。第四步：计数细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定。注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差2、间接计数法——一种活菌计数法②滤膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养），然后把滤膜贴到培养基上，细菌获得营养而生长，形成菌落。——大肠菌群测定2、间接计数法——一种活菌计数法③液体计数法（MPN法，mostprobablenumber法）最可能数法特点：液体培养、统计学查表计数主要用于不能在平板培养基上形成菌落的菌（硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）将菌接种于液体培养基，经过一段时间培养，采用一定的技术来检测是否有细菌生长。例如硫酸盐还原菌的检测是利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行检测，按MPN法进行计数。332010-410-510-6310-10-210-310-410-5（1）稀释（2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气恒温37℃培养14天记录变黑的试管情况（3）培养1ml+9ml培养基提问：为什么有些试管变黑有些没有？稀释程度、取样概率(4)统计－查表－计算①统计数量指标的确定根据不同稀释度变黑试管，得到三位数及其中最低稀释度取重复管数都有菌生长的最高稀释度的生长管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数提问：上例情况而言统计数量是几？32010-4MPN三管法测数统计表（个菌/毫升）数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数0000.01211.52234.03209.50010.31301.62303.032115.00100.32000.92313.532220.00200.62011.42324.032330.01000.62022.03002.533025.01010.42101.53014.033145.01100.72112.03026.5332110.01021.12123.03104.5333140.01100.72202.03117.51111.12213.031211.51201.12223.531316.0水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。上面例子中数量指标“320”对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为9.5x104个菌/毫升。②查MPN表（二）测生长量法（1）测体积：粗放的方法，离心或自然沉降后观察体积；（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种；105~110ºC下干燥后称重（干重约为湿重的10~20%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixedliquidsuspendedsolid）混合悬浮固体MLVSS（mixedliquidvolatilesuspendedsolid）550ºC、2h、马福炉细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比（3）比浊法/光密度法OD（opticaldensity）Λ＝450~660nm,可见光①制标准曲线（OD~No）②测菌液浊度，查图表得出细菌数量分光光度法测浊度1234其他细菌计数法细菌数量10100100010000个/mL细菌数量制标准曲线菌液浊度浊度仪或721分光光度仪（5）细胞含氮量细菌含氮量12.5%、酵母为7.5%粗蛋白量＝6.25×N量（6）DNA、蛋白质同一细菌所DNA和蛋白质的量相对稳定，所以可以测DNA、蛋白质。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物醌类1g细胞平均含1μmol醌类。（4）测细胞含碳量POC（particulateorganiccarbon）POC＝12Xmg/l特点：快、低浓度也可测TOC（totalorganiccarbon）：总有机碳DOC（dissolvedorganiccarbon）：溶解性有机碳3-1-3细菌的生长特性1.间歇培养（Batchcultivation）和生长曲线（growthcurve）将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。接种Fig.1Bacteriagrowthwithdifferentphosphorus(0～3µg/L)and10µgAOC/L0.0E+002.0E+054.0E+056.0E+058.0E+051.0E+061.2E+060369121518212427