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实验三大肠杆菌生长曲线的测定一、实验器材1．培养基及大肠菌液(1)营养琼脂斜面培养基可根据实验五中的配方，配置营养琼脂培养基后，再制成斜面。(2)肉膏蛋白胨液体培养基配制方法同实验五中营养琼脂培养基，但不加琼脂。(3)浓肉膏蛋白胨液体培养基配制方法同肉膏蛋白胨液体培养基，但浓度高5倍。(4)大肠杆菌培养液将大肠杆菌接种于营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18小时后，用无菌水加在斜面上，将菌洗下，作成一定浓度的细菌悬液，直接供实验接种用。或吸取0.3mL细菌悬液，接种到装有20mL肉膏蛋白胨液体培养基的大试管(20×220mm)内，在37℃下，振荡培养18h。2．吸管、烧杯等。3．光电比色计、高压蒸汽灭菌器、电冰箱、振荡器或摇床等。二、实验内容1．实验处理以一定浓度的细菌悬液，分别等量地接种在12支液体培养基中，在培养后隔不同时间取出，放入冰箱保存。最后，用比浊法测定菌体生长情况。测量微生物生长的方法有多种。活菌数可用平板计数(菌落计数)法或稀释计数法。总菌数(包括活菌和死菌的个数)可在显微镜下直接计数而求得，由于细菌悬液的浓度与其浑浊度成正比，因此也可利用光电比色计测定细菌悬液的光密度，从而推知菌液的浓度，本实验就是利用光电比色计进行量测（用平板计数法或稀释计数法可测出活菌数，从而得出不包括死菌的生长曲线。若教学时间和设备条件容许，宜采用平板计数法或稀释计数法）。为阐明生长曲线形成的原因，做3个实验处理：（1）正常生长曲线；（2）追加营养液处理；（3）加酸处理。2．实验步骤(1)接种取12支装有灭菌过的肉膏蛋白胨液体培养基试管(每管装20mL培养基)，贴上标签(注明菌名、培养时间等)。然后，用1支1mL无菌吸管，每次准确地吸取0.2mL培养18h的大肠杆菌培养液，接种到肉膏蛋白胨液体培养基内。接种后，轻轻摇荡，使菌体均匀分布。(2)培养将接种后的12支液体培养基，置于振荡器或摇床上。37℃振荡培养。其中9支，分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h后取出，放冰箱中储存，最后一起比浊测定。酸处理的1支试管，在培养4h后取出，加1mL无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1的体积比），然后继续振荡培养，在培养14h后取出，放入冰箱贮存。最后一起比浊测定。追加营养的两支试管，在培养6h后取出，各加入无菌浓肉膏蛋白胨液体培养基1mL，然后继续振荡培养，在培养8、14h后取出，放入冰箱贮存，最后一起比浊测定。(3)比色、过比浊把培养不同时间而形成不同浓度的细菌培养液，置于分光光度计中进行比色。用光密度值的大小来代表细菌的生长量。以未接种的肉膏蛋白胨液体培养基为空白对照，在600nm波长下测菌悬液的光密度值(OD600)。菌悬液的浓度与光密度值成正比，光密度值大者可以认为其生长情况较好。从最稀浓度的细菌悬液开始，依次测定。细菌悬液如果太浓，应适当稀释，使光密度降至0.0—0.4范围内。液体的浑浊度也可用浊度计测定。三、记录及报告要求1．记录培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h之后细菌悬液的光密度值，以及4h加酸和6h追加营养液后，这三管菌液在所要求的培养时间时的光密度值。2．以细菌悬液光密度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌正常、加酸和追加营养的3条生长曲线，并加以比较，标出正常生长曲线中对数期的大致位置。四、思考题1．常用的测定做生物生长的方法有哪几种?试略加讨论。2．利用浑浊度所表示的细菌生长量是否包括死细菌?3．你认为活性污泥的增长曲线应怎样测定才比较合适?