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实验七微生物纯种分离、培养及接种技术本实验的对象是水样或活性污泥中微生物的纯种分离和培养。通常，在处理不同水质的废水时，起作用的微生物群和种类也不同。我们除可用显微镜直接观察微生物形态，大致了解其中的微生物种群外，更重要的还必须研究是哪些种类的微生物对该种废水起生物氧化作用，其作用原理是什么，产生什么产物等等，以便提高处理效果。此外，有时我们还需从土壤环境中分离和培养纯菌种来处理工业废水。因此，为了从事以上这些研究工作，就必须学习微生物纯种分离、培养及接种的技术，进而再学会做微生物生理生化反应的实验，为废水处理服务。在给水处理的细菌检查中，细菌的分离、培养和接种也是一个重要环节。微生物纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。在本实验中仍要学习这两种方法。一、目的要求掌握几种常用的分离纯化物的基本操作技术。二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。纯培养的确定：1．确定其菌落观察特征；2．结合显微镜检测个体形态特征的确定。三、实验器材1．无菌培养皿(直径90mm)、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌试管、5管无菌水(每管有9mL灭菌过的自来水)。2．营养琼脂培养基(已灭菌的)、水样或活性污泥。3．接种环、酒精好(或煤气灯)、恒温箱(培养箱)等。以上器材，除水样或活性污泥、接种环、恒温箱外，均在实验五中准备好。四、操作方法及步骤(一)活性污泥的纯种分离与培养1．稀释平板分离(1)取样(2)稀释水样1)将5支装有9mL无菌水的试管以0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001（或10－1、10－2、10－3、10－4、10－5）依次编号。2)以无菌操作，用1mL的无菌吸管吸取1mL样品于第一管无菌水中，将吸管吸洗3次，摇匀，即为稀释10倍的菌液。再从此0.1浓度的菌液中吸取1mL于第二管中，将吸管吸洗3次，摇匀，即为稀释100倍的菌液，以同样方法，依次类推，分别得到稀释103倍、104倍及105倍的菌液，所得菌液分别为0.1、0.01、0.001、0.0001及0.00001(即10－1、10－2、10－3、10－4及10－5)等浓度。(3)平板的制作I)将无菌培养皿编号为0.1、0.01、……0.00001(10－1、10－2、…10－5)。2)另取一支lmL的无菌吸管从浓度小的10－5的菌液开始，依次分别取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(每个浓度做3个平板)。每次吸取时，吸管都应在菌液中反复吸洗几次。3)在稀释菌液的同时，就要将营养琼脂培养基加热融化，待融化的培养基冷到40一50°C左右(温度不可过高，否则微生物容易被烫死，温度过低，培养基容易凝固，平板不平)时，倾注10一15mL入上述盛有菌液的培养皿内(每一培养皿内应加入的培养基量须根据皿的大小决定，以能使培养皿底部铺满培养基而形成厚约2—3mm的薄层为适当，在直径为90mm的培养皿内注入10—15mL，可满足此要求)，如图7—2所示。在倾注前，应先将盛有培养基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微烧一周。培养基倾入后迅速盖上皿盖，培养基倾入后平放桌上，轻轻转动，使培养基和稀释菌液充分混合均匀，冷却后，即成平板。将培养皿倒置于30°C的恒温箱中培养24h，观察有无菌落长出。培养皿所以要倒置是为了防止培养基内水分蒸发到皿盖上而使培养基变干。2．平板划线分离。(1)取样同前。(2)制备平板培养基将融化的营养琼脂培养基以无菌操作倒入无菌的空培养皿内(操作方法同前，但培养皿内末注入菌液)。加盖，在平桌上转动，凝固后即成所需的平板。(3)划线以无菌操作，右手持经烧灼灭菌冷却的接种环从装有活性污泥的器皿中取一环活性污泥。同时左手持培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起一些，右手把接种环伸入培养皿，将一环活性污泥在平板表面轻轻地划线(千万不要戳破培养基平板)，可作平行划线、扇形划线，或其它连续划线。无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。划线后，将皿盖盖好。倒置培养皿于30°C恒温箱内培养24h，则平板上即长出菌落。接种环用过后即再烧灼灭菌。(二)其它一些接种的操作技术微生物的接种方法，除前面所提到的外，随着所用的培养基、实验目的等的不同，还有好几种，但是它们的基本操作都是类似的，并且都要严格注意无菌操作。1．斜面接种技术这是将微生物从一个斜面培养基(或平板培养基)上接种到另一个斜面培养基上的方法，见图8—10。斜面培养基可用小试管(15mm×150mm)制备，每管约装3一5mL(1／4一1／3试管高度)，见图7－3。(1)将试管贴上标签、注明菌名、接种日期等。(2)将培养好的菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其它4指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分。斜面向上，管口齐平，并使它们位于水平位置。(3)将棉塞用右手拧转松动，以利接种时拔出。(4)右手拿接种环，在火焰上将环烧灼灭菌，环上凡是在接种时可能进入试管的部分都应用火烧灼。(5)在火焰旁，用右手拔掉棉塞。(6)以火焰微烧试管口一周，烧灼时应不断地转动管口，使管口上可能沾污的少量菌或带菌尘埃得以烧去。(7)将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分(如斜面的顶端)，使其冷却，以免烫死被接种的菌种。然后轻轻挑取少许菌种，抽出接种环并迅速将接种环伸进另一试管，在培养基上轻轻划线(由底部向顶部划线)。(8)接种完后，将接种环取出，将试管塞好棉塞。2．液体接种这是由斜面培养基(或平板培养基)接种到液体培养基中的方法。(1)操作方法与前同，试管可略向上斜，以免培养基流出。(2)将取有菌种的接种环送入液体培养基时，可使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦，接种后，塞上棉塞。将试管在手掌内轻轻转动，使菌体在培养基中均匀分散。3．由液体培养基接种液体培养基接种用具常用无菌吸管或无菌滴管。无菌操作注意事项与前同，吸管或滴管要预先经干热或湿热法灭菌，不能在火焰上烧灼。具体操作较简单，只要用无菌吸管或滴管从有菌的试管吸取一定量的培养液到另一管液体培养基中，塞好棉塞即可。4．穿刺接种这是由斜面菌种接种到固体深层培养基的方法。培养基可装于大试管(20mm×220mm)内，每管约装12—15mL。(1)如前斜面接种操作，但用接种针(必须很挺直)取出少许菌种。(2)用左手斜握盛有固体深层培养基的试管，用右手将接种针移入培养基，自中心刺入，直到接近管底，但不要穿透。然后沿穿刺途径缓慢将针拔出。这样，接种线整齐，易于观察。将以上分离、接种的培养物置于恒温箱中在一定温度下培养一定时间后观察结果。接种环和接种针用毕后均应再烧灼灭菌。微生物的分离、培养、接种等操作，前已述及，最好在经紫外线灭菌的无菌室内或无菌箱内进行，要严格注意无菌操作。在没有无菌室或无菌箱的情况下，实验精度又要求不高时，则可在一般的实验室内进行，但必须特别注意无菌操作。五、思考题用一根无菌吸管取几种浓度的水样时，应从哪一个浓度开始?为什么?