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实验九微生物的生理生化特性微生物的代谢与呼吸，主要依赖于酶的活动。各种微生物具有不同的酶类，因此，它们对某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情况不同，代谢产物也有所不同。所以，我们可以利用各种微生物生理生化反应的特点来作为鉴别它们的一种依据。本实验以大肠菌群为例子。一、实验目的在水处理工程中，水源水要经过处理后才能供给用户。饮用水要求清澈、无色、无臭，更重要的是没有病原菌。因此，自来水在出厂以前要作水质的物理化学分析和细菌检验，本实验结合给水净化工程中的细菌检验，作细菌总数和大肠菌群的测定。通过大肠菌群的测定，了解大肠杆菌的生理生化特性。大肠菌群数系指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸盐杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，故测定结果不包括副大肠杆菌。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37°C经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数(实际上所表示的是腐生细菌的数目。腐生细菌在营养琼脂培养基上所形成的菌落呈白色细点状)。我国现行生活饮用水卫生标准GB5749—85规定：细菌总数是指1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。二、实验用具1．水样瓶任何具有玻璃塞、质量良好的玻璃瓶都可用。2．吸管、试管、锥形瓶等。3．稀释瓶稀释水样所用的玻璃瓶最好为瘦长形，并具有严密的玻璃塞，其容量要比实际用的水量大二倍，有时可在普通试管上加塞，作为稀释管。瓶口或管端须以纸或纱布包好扎紧。4．培养皿(平皿)—般采用直径90mm，高15mm的。5．发酵管和发酵瓶(图8—11)发酵管有大小之别，小发酵管可用15mm×150mm的试管，大发酵管和发酵瓶须有200mL以上的容量。管和瓶内都须装倒置的小试管(直径一般5—10mm、长20一40mm，小发酵管取用较小的小试管，大发酵管和发酵瓶取用较大的小试管)，这种小试管常称为倒管，用以聚集气体。6．接种环。7．细菌滤器。8．滤膜。9．高压蒸汽灭菌器。l0．恒温箱(培养箱)。11．电冰箱。12．显微镜。13．镜油(香柏油)、二甲苯、擦镜纸等。14．普通放大镜能放大五倍以上。15．pH电位计(或氢离子浓度比色计或pH精密试纸)。以上是一些主要的实验用具。测定细菌总数时需要l、2、3、4、9、10、11、14、15等1用具；发酵法检验大肠菌群时需要1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、15等用具；滤膜法检验大肠菌群则基本上需要上述全部用具。三、培养基及染色试剂本实验所需培养基及染色试剂有如下几种：营养琼脂培养基供细菌总数测定用乳糖蛋白胨培养基供大肠菌群检验“发酵法”用浓乳糖蛋白胨培养基同上品红亚硫酸纳培养基（甲）同上品红亚硫酸钠培养基（乙）供大肠菌群检验“滤膜法”用伊红美蓝培养基供大肠菌群检验“发酵法”用乳糖蛋白胨半固体培养基供大肠菌群检验“滤膜法”用革兰氏染色剂供大肠菌群检验用上述各种培养基及染色剂的成分与配制方法如下：(一)营养琼脂培养基成分及制法见实验五。(二)乳糖蛋白胨培养基1．成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mL2．制法(1)将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4。(2)加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于小发酵管（内有倒管）中，每管装10mL。(3)置高压蒸汽灭菌115℃（0.7kg/cm2）灭菌20min。(4)贮存于冷暗处备用。(三)浓乳糖蛋白胨培养基按上述“乳糖蛋白胨培养基”浓缩3倍配制。分装于发酵瓶或发酵管（内有倒管）中，每个发酵瓶或大发酵管装50mL，每个小发酵管装5mL。（四）品红亚硫酸钠培养基(甲)1．成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾3.5g琼脂20—30g蒸馏水1000mL无水亚硫酸钠5g左右5％碱性品红乙醇溶液20mL2．储备培养基的制备(1)先将琼脂加至900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000mL，调整pH为7.2~7.4。2(2)趁热用脱脂棉或纱布过滤(最好用保温漏斗)，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃（0.7kg/cm2）灭菌20min，贮存于冷暗处备用。3．平板的制备(1)将上法制备的储备培养基加热融化。(2)根据锥形瓶内培养基的量，用无菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于无菌空试管中。(3)根据锥形瓶内培养基的量，按比例称取所需的无水亚硫酸纳置于无菌空试管内，加无菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。(4)用无菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液中至深红色褪成淡粉红色为止。(5)将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加于已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)。(6)立即将此种培养基适量倾入己灭菌的培养皿内(90mm直径的培养皿约需培养基10一15mL)，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此种己制成的培养基于冰箱内保存亦不宜超过二周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。(五)品红亚硫酸钠培养基(乙)1．成分蛋白胨10g酵母浸膏5g牛肉膏5g乳糖10g琼脂20g磷酸氢二钾3.5g无水亚硫酸钠5g左右5％碱性品红乙醇溶液20mL蒸馏水1000mL2．培养基及平板的制备方法与“品红亚硫酸钠培养基(甲)”的制备法相同，但须加酵母浸膏和牛肉膏。(六)伊红美蓝培养基1．成分蛋白陈10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20—30g蒸馏水1000mL2%伊红水溶液20mL0.5%美蓝水溶液13mL2．储备培养基的制备(1)先将琼脂加入900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000Ml，调整pH为7.2—7.4。(2)趁热用脱脂棉或纱布过滤(最好用保温漏斗)，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶中，置高压蒸汽灭菌器内以115℃(0.7kg／cm2)灭菌20min。贮存于冷暗处备用。3．平板的制备(1)将上法制备的储备培养基加热融化。3(2)根据锥形瓶内培养基的量，用无菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2％伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液加入已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)。(3)立即将此种培养基适量倾入已灭菌的培养皿内(对于90mm直径的培养皿10—15mL)，待其冷却凝固后，置冰箱内备用。(七)乳糖蛋白胨半固体培养基1．成分蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏5g乳糖10g琼脂5g左右蒸馏水1000mL2．制法(1)将上述成分加热溶解于800mL蒸馏水中，调整PH为7.2—7.4，在用蒸馏水补充至l000mL，过滤。(2)分装于试管中，每管装入的培养基量均为试管容积的1/3。(3)置高压蒸汽灭菌器内以115℃(0.7kg／cm2)灭菌20min，贮存于冷暗处备用。培养基存放不宜过久，以不超过2周为宜。(4)此培养基制成后，需用已知大肠群菌株进行鉴定应在6—8h产生明显气泡。(八)革兰氏染色剂成分及配制方法见实验四。四、水样的采集和保存用于细菌检验之水样较化学分析所用的尤应谨慎采取。所取水样必须要保证其代表性。并在收集和保存时不得有所污染，瓶中水样不应完全装满，以便于检验前能彻底摇匀。采集水样的容器，可用清洁硬质玻璃瓶。容器必须经高压灭菌，保证无菌。并需保证水样在运送、保存过程中不受污染。如要从河湖或井水中取水，可用特制的采样器。图8-12所示的采样器系一金属框，内装有玻璃瓶，器的底部有重量，可随意坠入所需的深度，瓶盖上扎有绳索，拉起绳索即可打开瓶盖，松放绳索，瓶盖即自行盖上。取样前应对玻璃瓶先作灭菌处理。采集时将采样器浸入水中，使采样瓶口位于水面下10一15cm深处。然后拉开瓶塞，使水进入瓶中。水样采集后，应将水样瓶中水样倒入无菌储样玻璃瓶中，或将水样瓶取出，立即用无菌棉塞塞好瓶口，以备检查。采取自来水水样时，须先冲洗龙头，再用酒精棉烧灼灭菌，然后放水5一10min，接着将瓶移上取水。采取含有余氯的水样时，应在水样瓶未检验前接500mL水样加入1.5％硫代硫酸钠溶液2mL，以消除氯的作用。水样采集和分析的间隔时间应尽可能缩短。水样采取与检验相隔时间应在4h内。取样时要将取样日期、温度、水的来源、环境状况、水的用途等注明。4五、实验方法及步骤(一)大肠菌群的检验甲、发酵法发酵法是根据大肠菌群能发酵某些糖类而产酸产气等特性来进行检验的。1．生活饮用水按下列3个步骤进行检验：(1)初步发酵试验在2个各装有已灭菌的50mL浓乳糖蛋白胨培养基的发酵瓶或大发酵管(内有倒管)中，以无菌操作各加入水样100mL；在10支装有已灭菌的5mL浓乳糖蛋白胨培养基的小发酵管（内有倒管）中，以无菌操作各加入水祥10mL。混匀后置于37℃恒温箱中培养24h。观察其产气产酸的情况。1)如无气体和酸产生，则为阴性反应，表示无大肠菌群存在。2)如有气体和酸产生，或虽无气体产生，但有酸形成，则为阳性反应，表示此水可能为粪便污染，需作进一步的检验。3)如有气体形成，但没有产酸，溶液也不浑浊，则操作技术上有问题，须重作检验。(2)平板分离用无菌接种环，从前一阶段所需进一步检验的发酵瓶或发酵管中沾取菌液，分别在品红亚硫酸钠培养基(甲)或伊红美蓝培养基上划线。然后将培养皿置于37℃恒温箱内培养18一24h，记其结果如下：1)如无细菌增殖现象，可认为是阴性反应，无大肠菌群存在。2)如仅发现芒状、霉状或其它无关菌属的菌落，则表示无粪便性的污染。3)如发现有下列特征的菌落，则应取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。如涂片中没有革兰氏阴性的杆菌，则表示无大肠菌群存在；如涂片中有革兰氏阴性无芽孢的杆菌时，则进行复发酵试验。品红亚硫酸钠培养基上的菌落：1)紫红色，具有金属光泽的菌落。2)深红色，不带或略带金属光泽的菌落。3)淡红、中心色较深的菌落。伊红美蓝培养基上的菌落：1)深紫黑色，具有金属光泽的菌落。2)紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。3)淡紫红色，中心色较深的菌落。(3)复发酵试验用无菌接种环挑取上述涂片镜检显示革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的另一部分接种于已灭菌的装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的小发酵管(内有倒管)中，每管可接种分离自同一初发酵管或发酵瓶的最典型的菌落1—3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸产气者(不论倒管内气体多少皆作为产气论)，即证实大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管数或瓶数，查表8—l，报告每升水样中的大肠菌群数。大肠菌群检数表（一）表8—l10mL水量的阳性管数100mL水量的阳性管（瓶）数10mL水量的阳性管数100mL水量的阳性管（瓶）数012012每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数0＜3411622369213818727431202713278315116131118389366023054142452104069＞2305183070注：水样总量300mL（2份100mL，10份10mL）2．水源水(1)将水样作1：10稀释。稀释的方法：在用来稀释的试管(稀释管)内先盛以适量的自来水，使其灭菌后，其水量恰为9mL。此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。(2)于各装有5mL3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的5个试管中(内有倒管)，各加入10mL水样；于各装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的5个试管中(内有倒管)，各加入1mL水样；于各装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的5个试管中（内有倒管），各加入1mL稀释水样，共计15管，3个稀释度。以后的检验步骤同上述生活饮用水的检验方法。(3)根据证实有大肠菌群存在的阳性管数查表8—2，报告每升水样中的大肠菌群数。大肠菌群检数表（二）表8—2（总接种量55.5mL，其中5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样）接种量mL每100mL水样中大肠菌群近似数接种量mL每100mL水样中大肠菌群近似数1010.11010.10000100200121014002410260035103800