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第一节离心分离技术离心分离技术是借助离心机旋转的离心力使不同大小和密度的物质被分离的技术。在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。一、离心机的种类与用途离心机按离心机转速的不同可分为常速(低速)、高速和超速3种。1·常速离心机：常速离心机又称为低速离心机。其最大转速在8000r/min以内，相对离心力(R·C·F)在1×l04g以下。用于分离细胞、细胞碎片、培养基残渣、和粗结晶等较大颗粒的分离。2·高速离心机高速离心机的转速为l×l04~2.5×l04r/min，相对离心力达1×104~105g。主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。有些高速离心机装设了冷冻装置，谓之高速冷冻离心机。3·超速离心机：超速离心机的最大转速达2.5×l04~8×104r/min，最大相对离心力达5×105g，甚至更高一些。超速离心机的精密度相当高。低温是必须的。另外，为了减少空气限力和摩擦，还设置有真空系统。二、离心方法的选择一般选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果若样品中存在两种以上大小和密度不同的颗粒，则采用差速离心超速离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心等。1·差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。差速离心主要用于分离那些大小和密度差异较大的颗粒。操作简单、方便，但分离效果较差。三、离心条件的确定影响离心分离效果的因素主要是离心机的转速和离心时间及离心介质溶液的pH值和温度。1·离心力：物质颗粒在离心场中所受到的离心力的大小，决定于颗粒的质量（m)和离心加速度(ac)。Fc=mac离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径。ac=ω2rω－转子的角速度(rad/s)（rad－弧度－弧长等于半径时所对应的圆心角为1弧度，圆周的弧长为半径的2π倍，即圆周所对应的角度为2π个弧度）r－旋转半径(cm)若转速用每分钟转数(r/min)来表示，则:ω＝2πn/60代入上式，得到:ac=ω2r=4π2n2r/3600相对离心力是指颗粒所受的离心力与地心引力(重力)之比。即RCF=Fc/Fg=mac/mg=ac/g=4π2n2r/3600/980.6将有关数字代入上式，化简为：RCF=l.l2×10-5·n2r(g)式中RCF――相对离心力(g)n一一转子每分钟转数(r/min)r――旋转半径(cm)g――重力加速度(980cm/s2)由此可见，离心力的大小与转速的平方成正比，与旋转半径成正比。2·离心时间离心时间的概念，依据离心方法的不同而有所差别。差速离心时间→某种颗粒完全沉降到离心管底的时间;3·温度和pH值为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。离心温度一般控制在4℃左右。在超速和高速离心时，必须采用冷冻系统。离心介质溶液的pH值应该是处于酶稳定的pH范围内。第二节过滤与膜分离技术过滤是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析和电渗析等都属于膜分离技术。根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透4大类。过滤的分类及其特性类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜一、粗滤粗滤可分为以下3种。1·常压过滤：以液位差为推动力。2·加压过滤：以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。3·减压过滤：又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。二、膜分离技术二、膜分离技术借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小和不同性状的物质颗粒分离的技术，统称为膜分离技术。膜分离过程中，膜选择性地让小于其孔径的物质颗粒通过，而把大于其孔径的颗粒截留。1·加压膜分离以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。根据所截留的颗粒大小的不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透3种。(1)微滤微孔过滤。微滤膜截留的物质颗粒直径为0.2~2μm。主要用于分离细菌、灰尘等光学显微镜可看到的物质颗粒。在无菌水、软饮料、矿泉水等的生产中广泛应用。(2)超滤借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。超滤膜截留的颗粒直径从20~2000Å(0.2μm)。主要用于分离病毒和各种生物大分子。超滤膜一般由两层组成，表面厚度为0.1~5μm。基层厚度为200~250μm，强度较高。使用时要将表层面向待超滤的物料溶液。超滤过程超滤过程中，小分子物质与溶剂分子一同透过膜孔渗出。不同孔径的膜有不同的透过性。膜的透过性以流率表示。孔径大，流率大。超滤时流率为0·01~5mL/cm2•min。颗粒的性状与大小，溶液浓度，操作压力，温度和搅拌等条件对超滤流率也有明显的影响。影响流率的因素相对密度大、纤维状、非球状大分子及溶液的浓度高，流率低。压力增加时，超滤的流率增加。超滤时的操作压力一般控制在50~700kPa。压力一般由氮气来维持。提高温度，增加搅拌速度有利于提高流率。应用超滤技术在酶工程方面的应用，不仅使酶得以分离纯化还有酶液浓缩的目的。特别注意：对于那些需要小分子辅酶的酶的生产不适用。2、透析透析是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜到膜外，而大分子被截留，达到分离目的。透析膜可用动物膜等制成。以透析袋形式使用。透析过程及用途透析过程：准备透析袋→装样品→透析→收集样品。透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。也可用于溶液的脱盐等。第三节沉淀分离技术沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其他溶质分离。沉淀分离是酶的分离纯化经常采用的方法。沉淀分离的方法沉淀分离方法分离原理盐析不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，添加中性盐，使酶从溶液中析出沉淀等电点等电点时溶解度最低，不同的酶有不同的等电点，通过调节溶液的pH值，使酶沉淀析出有机溶剂酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出复合在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响酶，从而使酶与杂质分离一、盐析沉淀法。盐溶和盐析的原理盐溶：在低盐浓度的情况下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析：当盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质和酶的溶解度又随着盐浓度的升高而减少，结果使蛋白质和酶沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不同酶的溶解度各不相同。硫酸铵沉淀酶的盐析通常采用硫酸铵。优点：硫酸铵在水中的溶解度大而温度系数小25℃时，溶解度为767g/L0℃时，溶解度为697g/L不影响酶的活性，分离效果好价廉易得。怎样使用磷酸铵饱和度表25℃每升加硫酸铵的克数需要达到的硫酸铵的饱和度（％）%1020304060100原056114118767来1057694的9079饱和度0℃每100mL加硫酸铵的克数需要达到的硫酸铵的饱和度（％）%20304060100原010.616.469.7来105.310.962.7的907.0饱和度盐析注意事项采用什么样的盐浓度，在实际应用时，通过试验来确定。缓慢加盐。pH值调节到所需盐析的酶等电点附近。对于温度敏感的酶，在低温下进行。二、等电点沉淀法等电点沉淀法：酶在等电点时溶解度最低，不同酶具有不同等电点，对酶进行分离纯化的方法。原理：在溶液的pH值等于某酶的等电点时，该酶分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。在加酸或加碱调节pH值时，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱。三、有机溶剂沉淀法有机溶剂使溶液的介电常数降低。例如:20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液介电常数为40。溶液的介电常数降低，使溶质分子间的静电引力增大，溶质分子间的引力增大凝集沉淀。有机溶剂沉淀附加因素对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与溶液中的水相互作用，使分子周围的水膜破坏，也会使溶解度降低而沉淀析出。有机溶剂可能破坏酶和蛋白质的氢键等副键，使其空间结构发生某些改变，使原来在分子内部的疏水基团暴露于分子表面，形成疏水层，而使酶沉淀析出。有机溶剂沉淀的应用常用于酶沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇。有机溶剂的用量约为酶液体积的2倍。例：米曲霉α一淀粉酶用有机溶剂沉淀时，不同溶剂的最适浓度分别为：乙醇70%，丙酮60~62%，丙醇50%，异丙醇40~60%等。要注意这可能引起酶或蛋白的变性。有机溶剂沉淀法定的特点有机溶剂沉淀法析出的酶沉淀，比盐析法析出的沉淀易于离心分离或过滤不含无机盐，适用于食品工业用酶制剂的制备有机溶剂容易除去或回收容易引起酶的变性失活四、复合沉淀法方法：加入物质与酶形成复合物沉淀→分离沉淀→将酶从复合物中分离出来。能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶沉淀剂。常用的有单宁和聚丙烯酸等高分子聚合物。例一、单宁作为沉淀剂将酶液调到在pH4~7，在酶液中单宁，使之达到0.1~1％的浓度，形成酶与单宁复合物沉淀→分离沉淀→用丙酮或乙醇抽提除去沉淀复合物中的单宁。此法适用于各种来源的蛋白酶、α－淀粉酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶等的大规模生产。例二、以聚丙烯酸为沉淀剂将酶液调pH3~5，加入适量的聚丙烯酸，反应生成复合物沉淀。分离出沉淀后加水调pH值至pH6以上，复合物解离。加入Ca2＋，Mg2＋、Al3＋等金属离子，生成聚丙烯酸盐沉淀，酶游离出来。聚丙烯酸的用量为酶蛋白量的30~40%。第四节、层析技术20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，故称这种混合物分离的方法为色层分离法或色谱法(chromatography)。层析原理层析分离中一个相是固定的为固定相，另一相是流动的为流动相。当流动相流经固定相时，混合物中各种物质的物理化学性质的不同，各种物质在两相中的分布程度不同，各种物质的移动速度不同，使不同物质分离纯化。层析分离设备简单，操作容易，应用广泛。酶常用吸附层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等方法进行分离。分配系数(partitioncoefficient)分配系数用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。在一定的温度下达到平衡后，化合物在两相中浓度的比值为分配系数，用K表示:K＝固定相浓度/流动相浓度有效分配系数Keff＝K×固定相体积/流动相体积＝在固定相中的含量/在流动相中的含量最高的浓度在柱的中部。化合物的有效分配系数大于1，浓度的高峰在柱的中部以上有效分配系数小于1的化合物，浓度的高峰在柱的中部以下。平衡次数越多，在柱的某一位置上的化合物的浓度就越高数。层析法分类柱层析纸层析↖↗按操作形式分类↙↘薄层层析薄膜层析按两相所处的状态分类↙↘液相层析气相层析。吸附层析分配层析↖↗按层析过程的机理分类↙↘离子交换层析亲和层析一、吸附层析原理：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中的各组分分离的方法。吸附剂：通常用于酶的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、葡聚糖和活性炭等。操作条件：低pH值、低离子强度的条件下对酶有较强的吸附作用，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可被解吸洗脱。操作方法：可进行常规吸附柱层析，也可把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加进洗脱剂。特点：吸附层析的设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，具有一定