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第三章层析技术20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，故称这种混合物分离的方法为色层分离法或色谱法(chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离，1944年开始用滤纸作为固定相而出现了纸层析后，层析法不断发展，50年代开始，相继出现了气相层析、高压液相层析、薄层层析、薄膜层析、亲和层析、凝胶层析等，本章着重介绍几种重要的层析方法。1层析原理层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差别(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分布在两相中(其中一相为固定的，称固定相;另一相流过此固定相，称流动相)，从而使各组分以不同速度移动而达到分离，以对物质进行分离纯化或分析研究。分配系数(partitioncoefficient)通常被用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。在一定的温度下达到平衡后，化合物在两相中浓度的比值是一个常数及分配系数，用K表示:K＝在溶剂A中的浓度（固定相）/在溶剂B中的浓度（流动相）有效分配系数Keff＝K×固定相体积/流动相体积＝在固定相中的含量/在流动相中的含量分离的原理可以用一个装有5cm高固体颗粒的固定相柱来描述，固相的周围是移动的液相，每厘米的柱中有1mL的液相（流动相）。如果32μg的化合物在1mL的溶剂中被加到柱上，由于这的溶剂1mL进入柱而占据了A的位置，同时将有1mL的溶剂离开柱的底部。如果被加进的化合物在1cm高的柱子中的固定相和1mL流动相的有效分配系数是1，那么，它在固、液相之间的分配是相等的。如果再有1mL的溶剂被加到柱上，那么，A部分中的溶剂带着16μg的化合物向下移动到B，留下的16μg在A中。在A和B中化合物发生再分配，使8μg在溶剂中，8μg在固相中。再加入1mL溶剂到柱上取代A中的溶剂到B中，并把B中的溶剂取代到C，得到第三阶段中的化合物分配的情况，再加入1mL的溶剂，产生了在第四阶段中所表示情况，再加入1mL的量便成了第五阶段的情况。经过五次平衡后，化合物被分配到整个柱中，最高的浓度在柱的中部。如果化合物的有效分配系数大于1，那么，50%以上的化合物在每次平衡后仍留在固相中，浓度的高峰在柱的中部以上;在另外一种情况下，对于一个有效分配系数小于1的化合物，在柱内移动速度快，浓度的高峰在柱的中部以下。柱上发生的平衡次数越多，在柱的某一位置上的化合物的浓度就越高，因此有两个重要因素影响着一个混合物分离的图形。一个化合物通过柱展开的速度取决于它的有效分配系数，在柱上化合物的峰度取决于已发生的平衡的次次或者说是柱的理论塔板数(来源于工业上分馏塔的塔板数)。实际上，在一个柱上平衡是连续发生的，因为溶剂连续不断地被加入，在一根正常工作的柱中发生着数千次的平衡，平衡次数越多，柱的分离效率便越高。层析法分类经过近一个世纪的发展，层析法在坚持基本原理的原则下发展了多种类型，也有多种分类方法。按两相所处的状态分类：液相层析和气相层析。按层析过程的机理分类：吸附层析(absorptionchromatography):利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离的目的。分配层析(partitionchromatography):利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数(或溶解度)不同，而使之分离的方法。离子交换层析(ion-exchangechromatography):利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的方法。凝胶层析(gelchromatograaphy):利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。亲和层析(affinitychromatography):利用生物分子间亲和吸附的特异性不同，而进行分离的技术。按操作形式不同分类：柱层析(columnchromatography)，将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析(paperchromatography):用滤纸作液体的载体(担体support)，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析(thinlayerchromatography):将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以与纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。薄膜层析(thinfilmchromatography):常以聚酰胺薄膜为载体兼作固定相，以与纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。2分配层析2·1原理：分配层析是利用混合物中各组分在两种或两种以上不同溶剂中的分配系数不同而分离混合物中各组分的方法，相当于一种连续的溶剂抽提方法。如用带水的材料(载体)作为一种液相(固定相)，加入与水不相混合或仅有部分混合的溶剂为另一种液相(流动相)，则混合物各组分在两相中发生不同的分配而逐渐分开，形成层析谱。载体在分配层析中只起负载固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，也可用稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相刚采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。纸层析是应用最广泛的一种分配层析，以滤纸为载体，滤纸上吸附着水(约含水20%-22%)，是经常使用的固定相。某些有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把欲分离的物质加在滤纸的一端，使流动相溶剂经此移动，这样待分离物就在两相产生分配现象。由于样品中各物质的分配系数不同，就逐渐在纸上分别集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成分，随流动相移动的速度较漫；反之，在流动相中分配趋势较大的成分，移动速度就较快。物质在纸上的移动速率可以用Rf值表示。Rf＝色斑中心至原点中心的距离/溶剂前缘至原点中心的距离物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，因而移动速率(Rf值)也恒定，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。Rf值由两个因素决定:即物质在两相间的分配系数及两相的体积比。2．2影响因素：由于在同一实验条件下，两相体积比为一常数，所以Rf值主要取决于分配系数K。因此，凡能影响分配系数的因素，均能影响Rf值。这些因素主要有:2·2·1物质结构与极性：在纸层析中，极性物质易进入固定相，非极性物质易进入流动相。所以，决定分配情况的主要因素是物质极性的大小。极性大的物质其Rf值较小。2·2·2·层析溶剂：同一物质在不同的溶剂中Rf值不同。选择溶剂时应考虑被分离物质在溶剂系统中的Rf值需要在0.05-0.85之间。两个被分离的物质Rf值相差最好大于0.05。溶剂选择的原则是：(1)溶剂与被分离物质、多元溶剂各组分之间，不起化学反应。(2)溶剂系统中含水量对Rf值影响很大，应严格控制溶剂配比和温度，使含水量恒定。(3)为了增加两相互溶，防止分层，并克服某些溶质在有机相中溶解度过小的困难，一般在推动剂中加入一定量的酸或碱。2·2·3pH：当溶剂的pH改变时,溶质的解离度随之改变,解离度越大,极性越强,Rf值越小。2·2·4温度：温度可影响分配系数，还影响溶剂组成及纤维素的水合作用。纸层析应在恒温下进行。2·2·5滤纸：对层析滤纸的要求是质地均一，薄厚适当，松紧适中，纯度较高，机械强度好。必要时需进行空白层析，干燥后再使用。2·2·6展开方式：上行展开的Rf值较小，下行展开的Rf值较大。当固定相是有机相，流动相是含水溶剂时，称为反相层析。3凝胶层析4·1原理凝胶层析又称分子筛层析、分子排阻层析或凝胶过滤，主要根据混合物中各种分子的大小及形状不同，其通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速率各异，使大小不同的分子得到分离和纯化。凝胶颗粒是多孔性的网络结构。凝胶作为一种层析介质，经过适当的溶剂平衡后，装人层析柱，构成层析床。当含有分子大小不一的混合物样品加在层析床表面时，样品随大量溶剂下行，这时分子较大的物质(阻滞作用小)就沿凝胶颗粒间孔隙随溶剂流动，流程短而移动速率快的先流出层析床；但分子较小的物质(阻滞作用大)，其颗粒直径小于凝胶颗粒网状结构的孔径，可渗人凝胶颗粒，流程长而移动速率慢，比分子大的物质迟流出层析床(图1一3一5)。3·2凝胶过滤的特点(1)凝胶过滤一般不变换洗脱液，一次装柱后，可反复使用多次，每次洗脱过程也就是再生过程，不必经过回收处理，可以连续使用，因此操作简单、快速而且经济。(2)实验具有高度的可重复性，样品回收几乎可达100%，如果按比例扩大柱的体积和高度，可进行大量样品的分离纯化。(3)是一种极其温和的方法，不易引起生物样品的变性失活。(4)凝胶过滤的缺陷：A必须保证样品和洗脱剂的粘度很低，以利于溶剂的有效移动和溶质分子在层析床中的自由扩散。B由于凝胶颗粒网络孔径的大小是非常有限的，所以可被纯化的物质的相对分子质量范围受到限制。C凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，例如芳香族物质及脂蛋白等。凝胶的分离范围从相对分子质量数百(102)到近亿(108)。现将常用的凝胶分离的范围列入表1一3一2。凝胶过滤法广泛用于生物大分子如蛋白质、酶、核酸等的分离和提纯(包括脱盐、浓缩等)，并应用于微量放射性物质的分离。目前使用的商品凝胶如琼脂糖凝胶可分离的相对分子质量最大达107，故可用以分离相对分子质量大的核酸与蛋白质。凝胶过滤法还可用来测定蛋白质的相对分子质量。4离子交换层析4．1基本原理离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，使离子在层析柱中移动时达到分离的目的。离子交换剂具有酸性或碱性基团，分别能与水溶液中阴离子或阳离子进行交换。它的交换过程由五个步骤组成:①离子扩散到树脂的表面。在均匀的溶液中这个过程是非常快的。②离子通过树脂扩散到交换位置。这过程由树脂的交联度和溶液的浓度所决定，是控制整个离子反应的关键。③在交换位置上进行离子交换。这被认为是瞬间发生的，并且是一个平衡的过程。被交换的离子所带的电荷越多，它与树脂的结合越紧密，被其他离子所取代就越困难。④被交换的离子通过树脂扩散到表面。⑤用洗脱液脱附，被交换的离子扩散到外部溶液中(图1一3一6)。如有两种以上的成分被交换在离子交换剂中，再用另一洗脱剂洗脱时，亲和力(即静电引力)强的离子移动较慢，而亲和力弱的离子先洗脱下来，由此可将各成分分开。4·2交换反应及离子交换剂交换反应示意：①阳离子交换：树脂－О－┅A++B+＝树脂－О－┅B++A+②阴离子交换：树脂－О+┅A－+B－＝树脂－О+┅B－+A－目前采用的大多是合成离子交换剂，即离子交换树脂。离子交换树脂是人工合成的高分子化合物，一般呈球状或无定形颗粒状。离子交换树脂分为两大类:分子中具有酸性基团、能交换阳离子的称为阳离子交换树脂;分子中具有碱性基团、能交换阴离子的称为阴离子交换树脂。按其解离性大小，又可分强弱两种。强酸性基团有：P、SM、SE、SP。弱酸性基团有CM。强碱性基团有：QAE、TEAE。弱碱性基团有：DEAE、AE。常用的是CM和DEAE。支撑物通常用纤维素、葡聚糖和琼脂糖凝胶。强性适应的pH广、弱性窄。强性选择性小；弱性选择性高。如CM交换剂分离碱性氨基酸及强酸强碱化合物。强酸性阳离子交换剂对正电荷胶体和高分子阳离子不易吸附，故采用CM交换剂分离碱性蛋白质及酶。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶剂，平衡不断按正反应方向进行，直至完成交换过程。离子交换层析多采用柱层析的方式进行，即在层析柱中装上处理好的离子交换树脂，进行层析以分离混合物中各样品。离子交换层析广泛用于蛋白质、核酸以及氨基酸、核苷酸、生物碱等可解离代谢物的分离纯化。5亲和层析·1基本原理亲和层析是利用生物大分子物质能与相应的配基专一可逆结合的原理，而分离纯化大分子物质的方法(图1一3一7)。如果将配基共价连接在固相载体上制成吸附系统，则通过层析柱的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，使之与其他杂质分离开来，从而达到纯化的目的。由于这是利用生物大分子物质的生物功能进行层析的，提纯效果远大于其他层析，有时一步操作就能提纯100倍，甚至1000倍，得率高，操作简便，分离也快速