搜索
第四章电泳技术•各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。电泳作为一项生物化学研究的方法是在1937年Tiselius等人改进了电泳仪使之具有高度准确性以后，电泳技术才得到了较大的发展。20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，并先后找到滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉及琼脂作为支持物。•60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术的应用越来越广泛，从分离小分子，如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的生物大分子，如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定。已成为生化分析分离不可缺少的一门重要技术。电泳基本原理•任何带电物质由于其本身的解离作用或表面上吸附其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如，蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基(一NH3＋)和羧基(一COO－)，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电。带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质和溶液的pH以及离子强度。•在某一pH条件下蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零，此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH，称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出H＋而带负电，此时蛋白质分子在电场中向正极移动。如果溶液的pH值小于pI，则蛋白质分子结合一部分H＋而带正电，此时蛋白质分子在电场中向负极移动。•由于带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一带电颗粒在不同电场中泳动速度是不同的，其泳动情况用迁移率来表示。•迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，可用以下公式表示：•m=v/E=Q/6πrη•m：迁移率（cm2/V·s）；v：颗粒泳动速度（cm/s）；E：电场强度（V/cm）；Q：被分离物所带净电荷；η：介质粘度；r：颗粒半径。•由上式可见迁移率与球形颗粒半径、介质粘度、颗粒所带净电荷有关。•带电颗粒在电场申的泳动速度与本身所带净电荷的数量，颗粒的大小和形状有关。一般说，所带的电荷数量越多，颗粒越小越接近球形，则在电场中泳动速度越快，反之，则越慢。4．2影响迁移率的主要因素•迁移率是胶体颗粒的物理常数，可用来鉴定蛋白质以及研究它们的某些物化性质，被分离物质迁移率除受其本身性质影响外，还与其他外界因素有关。影响颗粒迁移率的外界因素讨论如下。4·2·1电场强度•也称电位梯度或电势梯度。所谓电场强度是指每厘米支持物的电位差，在一定大小的电场中，带电颗粒的泳动受所用电压的控制，电压越高，带电颗粒泳动越快，同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同。在电泳中，带电颗粒的迁移率与电流成正比，与电阻成反比。•根据电场强度的大小，可以将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者电场强度为2～10V/cm，后者为70～200V/cm，常压电泳时间长，需数小时到数十小时，高压电泳时间短，有时仅需几分钟。溶液pH•由于蛋白质、氨基酸等的电离度a随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率(U)，即:•U=m·a•因此，在电泳时选用一定pH的缓冲液非常重要。•pH决定带电颗粒的解离程度，在距样品等电点pI越远的pH溶液中，样品所带的电荷量越多。•为使电泳时的pH恒定，必须选用适当的缓冲液作为电极缓冲液，颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快;反之，则越慢。因此，分离某种蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，才能使被分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异，更有利于彼此的分开。4·2·3溶液的离子强度（ionicstrenght)•离子强度影响颗粒的电动电势，缓冲液离子强度过大，溶液中的离子会分担大部分电流，而使被分离的粒子迁移速度变慢。一般最适的离子强度在0.02~0.2mol/L之间。•一个单单价(如NaCl、KCl)电解质的离子强度就等于其浓度；一个单双价或双单价(如Na2SO4、CaCl2)电解质的离子强度，等于其浓度的三倍。而ZnSO4、CuSO4等双双价电解质的离子强度，就等于其浓度的四倍。因此只要知道溶液的浓度，即可计算出溶液的离子强度。4.2.5温度的影响•电泳过程中由于通电引起温度升高，致使介质粘度下降，颗粒运动加剧引起自由扩散变快，迁移率增加。为防止温度的升高，避免热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可将电泳槽置冰箱里进行电泳或在电泳系统中安装冷却散热装置。4·3凝胶电泳•4·3·1聚丙烯酰胺凝胶电泳•聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。它是在淀粉凝胶电泳的基础上发展起来的。此法在分子生物学、生物化学以及临床等方面具有广泛的应用。4·3·1·lPAGE的优点•(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。调节单体浓度或单体和交联剂的比例，就能得到孔径不同、范围广泛的凝胶物质，而且重复性好。•(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，对温度和pH变化不敏感。•(3)聚丙烯胺酰凝胶是－C－C－C－C－C－连接的多聚体，侧链除带有不活泼的胺酰基外，不带有任何其他离子基团，故无电渗作用。•(4)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，弹性大，无色透明，有利于电泳后进行各种处理。•(5)设备简单，所需样品量少(1～100μg)，分辨率较高。用此方法进行超微量分析时，可检出含量在10－9mol/L左右的样品。•PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量分析及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。4·3·1·2聚丙烯酚胺凝胶的聚合•聚丙烯酰胺凝胶是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂（crosslinker)，又称为共聚体的N，N一甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。在催化剂过硫酸铵[ammoniumpersulfate(NH4)2S408,简称AP]和加速剂N，N，N'，N'一四甲基乙二胺(N，N，N'，N'一tetramethylethylenediamine，简称TEMED)的作用下，聚合含酰胺侧链的脂肪族长链，相邻的两个链由甲叉桥连接起来的三维网孔结构。•催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有两种催化体系（1、化学聚合；2、光聚合。）介绍一种最常用的化学聚合足够用了。1、化学聚合。•化学聚合的催化剂一般是过硫酸铵，加速剂是脂肪叔胺，如四甲基乙二胺即TEMED[(CH3)2N一CH2一CH2一N(CH3)2]，三乙醇胺和二甲基氨丙腈等。其中以TEMED为最好。它的碱基可以催化过硫酸铵[(NH4)2S2O8]立即产生自由硫酸基，硫酸自由基的氧原子激活丙烯酰胺单体连接形成单体长链。含有这种丙烯酰胺单体长链的溶液尽管比较粘稠，但不能形成凝胶。只有当交联剂(Bis)存在时，才能形成凝胶。Bis将单体长链连接成网状结构。•在过硫酸铵一TEMED催化系统中，Acr和Bis聚合的初速率与硫酸铵浓度的平方根成正比，并且在碱性条件下反应迅速。此外，温度、氧分子和杂质等都会影响聚合速度。温度较高聚合较快，溶液预先抽气的比不抽气的聚合快。4·3·1·3丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺量的确定•聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于胶的浓度和交联度(Bis在胶中的分含量)。例如7·5%的胶，平均孔径5nm，30%的胶孔径为2nm。若Bis与Acr之比由1:15改变到1:60，则明显改变了胶的分子筛性质，使同工酶的相对迁移率增大，如乳酸脱氢酶的相对迁移率由0·148变到0·273。凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长；反之迁移速度快，电泳时间短。•通常凝胶的筛孔、透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。凝胶总浓度(T)的计算公式如下:•T＝[(A+B)/M]×100%•式中叫代表Acr的重量(g)；B代表交联剂Bis的重量(g);M代表溶液的体积(mL)。•交联度(C)可按下式计算:•C=[B/(A+B)]×l00%•A与B的比值(W/W)对凝胶的筛孔、透明度和机械强度等性质也有明显影响。A/Bl00时，5%凝胶成糊状，且易断裂。由此可知，凝胶浓度不同，其交联度是不同的。交联度随着总浓度的增加而降低。要制备完全透明而又有弹性的凝胶，应将A/B控制在30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Acr2%，Bis0·5%，凝胶就不能聚合。当增加Acr的浓度时要适当降低Bis的浓度。通常T为2%～5%时,A/B＝20，T为5%～10%时，A/B＝40左右;T为15%～20%时，A/B为l20～200左右。4·3·1·4凝胶浓度的选择•由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同。当分离物的相对分子质量已知时，可参考表1-4-1选择凝胶的浓度。•在操作时，可根据被分离物的分子大小选择所需要的凝胶的浓度范围，也可进用7·5%的凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。4·3·1·5分离效应•由于聚丙烯酰胺凝胶电泳是将含有样品胶、浓缩胶和分离胶的玻管或玻板放在含有Tris-甘氨酸(pH8，3)缓冲液的电泳槽内进行的，而这种电泳系统的孔径、pH、缓冲液三者都是不连续的，这种不连续的电泳之所以有很高的分辨率是因为有三种效应:即浓缩效应(在样品胶和浓缩胶中进行)、分子筛效应和电荷效应(在分离胶中进行)。(1)浓缩效应•当样品胶和浓缩胶选用pH6·7Tris/HCl缓冲液，电极液选用pH8·3Tris/甘氨酸缓冲液时，在电泳的开头，盐酸几乎全部解离释放出氯离子(Cl-)，甘氨酸在pH6·7的凝胶缓冲体系中只有1%～0·1%解离释放出甘氨酸根离子(H2N一CH2一COO-)，而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为带负电荷的离子。这三种离子带有相同类型的电荷，并同时向正极移动，其有效迁移率(m·a)按如下次序排列:•mClaClmPaPmGaG•根据有效迁移率的大小区分，把最快的Cl-称为快离子(又称前导离子，leadingion);把最慢的称为慢离子H2N一CH2一COO-(又称尾随离子，trailingion)。在电泳刚开始时，三层凝胶(样品胶、浓缩胶和分离胶)中都含有快离子，只是电极缓冲液中含有慢离子。电泳进行时，由于快离子的迁移率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后面形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电场强度与电导成反比关系:•E=I/η•在低电导区就产生了较高的电场强度。这种环境使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电场强度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一稳定而又不断向阳极移动的界面，也就是说，在高电场强度区和低电场强度区之间形成一个迅速移动的界面。•由于样品蛋白质的有效迁移率正好介于快、慢离子之间，因而它就聚集在这个移动界面的附近，被浓缩为一个狭窄的中间层。一般样品可浓缩300多倍。样品被浓缩的程度与其本身浓度无关，而起决定作用的因子是Cl－的浓度，当Cl－浓度高时，样品被浓缩的程度也高。•当样品进入pH8·9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此Cl－及H2NCH2COO-沿着离子界面继续前进，蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，然后再分成多个区带。因此，浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。在样品胶和浓缩胶中，要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快慢离子之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。(2)电荷效应。•蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，并形成一狭窄的高浓度蛋