西南林大现代生化仪器分析课件11高效毛细管电泳分析

2023/3/10第十一章高效毛细管电泳分析一、高效毛细管电泳分析法highperformancecapillaryelectrophoresis第一节概述generalizationHighperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE2023/3/10高效毛细管电泳分析highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛细管电泳采取了两项重要在技术上：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。•毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。•电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，•高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。2023/3/10分离过程电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。（动画）2023/3/10内容选择结束第一节概述generalization第二节高效毛细管电泳的理论基础basictheoryofHPCE第三节高效毛细管电泳仪器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四节高效毛细管电泳的分离模式separatetypesofHPCE第五节应用与进展applicationandadvancesofHPCE10:38:09第十一章高效毛细管电泳分析法一、PHCE基本原理basicprinciplesofPHCE二、电渗现象与电渗流electroosmosisandelectroosmoticflow三、影响电渗流的因素factorsinfluencedelectroosmosis四、淌度mobility五、PHCE中的参数与关系式parametersandrelationinHPCE六、影响分离效率的因素factorsinfluencedseparationefficiency第二节高效毛细管电泳理论基础highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEbasictheoryofHPCE10:38:09一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理basicprinciplesofPHCE电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)10:38:09所以，迁移速度：（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度μ：单位电场强度下的平均电泳速度。10:38:09二、电渗现象与电渗流electroosmosisandelectroosmoticflow1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。10:38:092.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。10:38:09HPCE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。10:38:094.HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。10:38:095.HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。10:38:09请选择内容第一节概述generalization第二节高效毛细管电泳的理论基础basictheoryofHPCE第三节高效毛细管电泳仪器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四节高效毛细管电泳的分离模式separatetypesofHPCE第五节应用与进展applicationandadvancesofHPCE结束2023/3/10第十一章高效毛细管电泳分析法一、高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus二、流程与主要部件processandmainassembly三、进样方式injectionmethod第三节高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEhighperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2023/3/10一、高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2023/3/10仪器22023/3/10仪器32023/3/10二、仪器流程与主要部件processandmainassembly•电压：0～30kV；•分离柱不涂敷任何固定液；•紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）2023/3/101.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度=1m2023/3/103.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；4.检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-18～10-19离子灵敏，需专用的装置；2023/3/10三、毛细管电泳的进样方式injectionmethodofHPCE进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样2023/3/10毛细管一端插入样品瓶，加电压；2.电动进样方式2023/3/10内容选择结束第一节概述generalization第二节高效毛细管电泳的理论基础basictheoryofHPCE第三节高效毛细管电泳仪器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四节高效毛细管电泳的分离模式separatetypesofHPCE第五节应用与进展applicationsandadvancesofHPCE2023/3/10第十一章高效毛细管电泳分析法一、毛细管区带电泳(CZE)capillaryzoneelectrophoresis二、毛细管凝胶电泳(CZE)capillarygelelectrophoresis三、胶束电动毛细管色谱micelleelectrokineticcapillaryelectrophoresis四、毛细管等电聚焦(CIEF)capillaryisoelectricfocusing五、毛细管等速电泳capillaryisotachophoresis第四节高效毛细管电泳分离模式highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEseparatetypesofHPCE2023/3/10分离类型八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同；2023/3/10一、毛细管区带电泳capillaryzoneelectrophoresis，CZE带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；2023/3/10二、毛细管凝胶电泳capillarygelelectrophoresis，CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。2023/3/101.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2023/3/102.电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；2023/3/101.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦capillaryisoelectricfocusing，CIEF2023/3/104.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的